EMSA实验方案翻译

第一次EMSA实验1.实验设计首次实验为确保系统的正确工作和操作的正确性，设计将ControlSystem和TestSystem一起电泳。聚丙烯酰胺凝胶泳道共10个，“#number”表示泳道序号。Table1.Controlreactionsfortheexpectedresults.ComponentFinalAmountControlReactions#1#2#3UltrapureWater----12μl11μl9μl10×BindingBuffer1×2μl2μl2μl50%Glycerol2.5%1μl1μl1μl100mMMgCl25mM1μl1μl1μl1μg/μlPoly(dI·dC)50ng/μl1μl1μl1μl1%NP-400.05%1μl1μl1μlUnlabeledEBNADNA4pmol--------2μlEBNAExtract1Unit----1μl1μlBiotin-EBNAControlDNA20fmol2μl2μl2μlTotalVolume----20μl20μl20μlTable2.BindingreactionsfortheTestSystem.ComponentFinalAmountReactions#4#5#6#7#8#9#10----5L1D5L6DW0PPP0P3UltrapureWater----10×BindingBuffer1×2μl2μl2μl2μl2μl2μl2μl1μg/μlPoly(dI·dC)50ng/μl1μl1μl1μl1μl1μl1μl1μlOptional:50%Glycerol2.5%1μl1μl1μl1μl1μl1μl1μlOptional:1%NP-400.05%1μl1μl1μl1μl1μl1μl1μlOptional:1MKClOptional:100mMMgCl25mM1μl1μl1μl1μl1μl1μl1μlOptional:200mMEDTAUnlabeledTargetDNA4pmol----------------------------ProteinExtract2μg----BiotinEnd-LabeledTargetDNA20fmolTotalVolume----20μl20μl20μl20μl20μl20μl20μl进一步实验根据第一次实验结果，不同时期探针结合情况不同，以另外两批材料的核蛋白重复实验各一次；若实验结果显示某个时期结合较为明显，可选择结合最显著的时期的核蛋白进行下一步竞争实验验证，设计不同浓度梯度的UnlabeledTargetDNA(coldprobe)特异性竞争结合，排除非特异性结合的可能；最后在与探针结合的蛋白的位置凝胶切下测序。2.实验准备2.1试剂注意：试剂瓶一律使用强酸过夜浸泡，并用自来水冲洗20次，超纯水冲洗20次，并过夜浸泡，使用过程避免交叉污染。500ml5×TBE（0.22μm水系滤头过滤）：Trizma(Tris)……………………27gBoricacid………………………13.75g0.5mol/LEDTA-Na+(pH8.0)…10ml或直接加Na2EDTA·2H2O…………1.86g超纯水400ml溶解，定容到500ml，室温保存，使用前用0.22μm水系滤器过滤；25ml40%Acrylamide（丙烯酰胺/甲双叉丙烯酰胺：19﹕1）：Acrylamide………………………9.5gBIS………………………………0.5g超纯水10ml溶解，定容至20ml，0.45μm水系滤器过滤，于棕色瓶中4℃保存；显影液和定影液：按照试剂说明配制，可用无特殊处理的量筒配制，可重复使用3~4次；1ml10%AP（过硫酸铵；不可使用过旧的）:AP………………………………0.1g去离子水………………………..1ml溶解后储存于4℃，2周内有效；50ml5MNaCl：NaCl…………………………14.61g去离子水…………………….40ml溶解，定容至50ml，高温高压灭菌，4℃保存；50ml0.5MEDTA(pH8.0)：Na2EDTA·2H2O…………9.305g去离子水………………….40ml+NaOH约1g调节pH至8.0，定容至50ml，高温高压灭菌，室温保存；50ml1MTris-HCl(pH7.5)：Trizma(Tris)…………….6.055g去离子水……………….40ml+3.5ml浓HCl，冷却至室温，调节pH至7.5，定容至50ml，高温高压灭菌，室温保存；50%Glycerol（配胶用）：Glycerol……………1ml去离子水…………1ml0.22μm水系滤器过滤；1%NP-40；TEMED；EBNAControlSystemcomponents；TestSystemsamples；UltrapureWater；2.2设备仪器100ml、500ml量筒；电泳及转膜设备（包括冰袋和泡沫箱）；大摇床；紫外超净工作台；10ml小烧杯；6个大培养皿；尼龙膜；滤纸；水浴锅；250ml锥形瓶1个；保鲜膜；暗盒；X-射线胶片；0.45μm和0.22μm滤头；2.3探针退火接头退火流程：（推荐使用PAGE方法纯化后的Oligo进行退火连接，也可以选择其他商业提供的高亲和柱纯化或HPLC纯化方式。）A：为了建立接头退火反应体系，需将下列成分混合：（需根据Oligo的浓度和退火反应的总体积调整各成分体积，根据实验所需调整退火探针的量）体系成分终浓度Oligonucleotide1100nmol/mlOligonucleotide2100nmol/ml10×退火缓冲液*1×DEPC-Treatedwater适量*10×退火缓冲液成分：100mMTris-HCl(pH7.5),10mMEDTA,1MNaClB：将oligo溶液放在65℃或者更高温度下孵育10min（保持恒定温度和时间至关重要！）。随后，将oligo溶液取出，并在室温下缓慢冷却（1~2小时）。C：将连接好的接头于-20℃保存。3.实验步骤3.1PrepareandPre-RunGel制胶：按Table3试剂表制胶。Table3.6%Polyacrylamideminigel.ComponentVolume5×TBE(过滤)1ml40%Acrylamide1.65ml50%Glycerol(过滤)0.5mlTEMED10μlUltrapureWater6.78ml脱气10min10%AP60μlTotalVolume10ml室温放置30min，同时准备电泳设备和0.5×TBE电泳缓冲液。预电泳：加0.5×TBE电泳缓冲液，静置5min，观察无漏，则继续加缓冲液至没过金属线；100V，13~15mA预电泳（可直接调节电流，不调电压）至电流恒定，30~60min。同时配制0.5×TBE放入4℃冰箱预冷，为电转运作准备。3.2PrepareandPerformBindingReactions①冰上解冻EBNAControlSystemcomponents和TestSystemsamples（不要涡旋和用手捂热），使用时再室温解冻EBNAExtract。②根据Table1和Table2配制20μl体系，室温孵育20min。③添加5μl5×LoadingBuffer到各20μl反应体系，上下吹打数次，充分摇匀，不要旋涡或剧烈混匀。3.3ElectrophoreseBindingReactions切断电源并冲洗胶孔，加各样品20μl到胶孔中，打开电流（设定为100V为8×8×0.1厘米凝胶），样品中溴酚蓝染料迁移电泳到凝胶长度约2/3到3/4处。在6％凝胶中游离的biotin-EBNAControlDNAduplex位于溴酚蓝迁移后面。3.4ElectrophoreticTransferofBindingReactionstoNylonMembrane①0.5×TBE浸泡尼龙膜至少10min。②按照“（底）海绵+滤纸2层+凝胶+尼龙膜+滤纸2层+海绵”将膜等放在一个干净的电泳转移槽中（避免使用已被用于免疫印迹海绵），加0.5×TBE电泳缓冲液至没过海绵。③380mA（~100V）转膜45~60min，转运过程准备交联设备，并将BlockingBuffer和4×WashingBuffer于50℃水浴至所有颗粒溶解。④完成后，将膜的溴酚蓝一侧（与凝胶相贴一面，即正面）朝上放置于干纸巾上。（在凝胶中不应有任何残留的染料）不要让膜干燥，立即进行下一步。3.5Cross-linkTransferredDNAtoMembrane超净工作台紫外灯下10cm左右照射10min。3.6DetectBiotin-labeledDNAbyChemiluminescence①BlockingBuffer和4×WashingBuffer可以在室温和50℃之间使用，保持所有的颗粒留在溶液中。SubstrateEquilibrationBuffer可在4℃和室温使用之间。②封闭膜：尼龙膜正面朝上（以下操作均保持膜正面朝上）于培养皿中加20mlBlockingBuffer，并45rpm孵育15min。③准备conjugate/blockingsolution：20mlBlockingBuffer中加入66.7μlStabilizedStreptavidin-HorseradishPeroxidaseConjugate（1:300稀释）。④倒出膜中的BlockingBuffer，加入conjugate/blockingsolution。45rpm孵育15分钟；同时，准备1×washsolution：40ml4×WashBuffer+120mlultrapurewater。⑤膜转移到一个新培养皿，用20ml1×washsolution洗，45rpm轻轻摇动5min，共洗膜4次。⑥膜转移到一个新培养皿，并加入30mlSubstrateEquilibrationBuffer，45rpm孵育5分钟；关灯：准备SubstrateWorkingSolution：6mlLuminol/EnhancerSolution+6mlStablePeroxideSolution。注：暴露在阳光下或任何强光都会破坏WorkingSolution，应保存在棕色瓶并避免长时间暴露在强光下；短期暴露于通常的实验室灯光不会破坏溶液。⑦将膜从SubstrateEquilibrationBuffer中取出，用纸巾小心地吸去膜边缘的缓冲液；将膜放在一个干净的保鲜膜上；将SubstrateWorkingSolution倒到膜上，完全覆盖表面，静置孵育5分钟。⑧从WorkingSolution中取出膜，将膜的一侧放到纸巾上吸2-5s，以除去多余的缓冲液。不要让的膜变得干燥；用保鲜膜包裹湿润的膜，避免气泡和皱纹。⑨膜放置在暗盒中2-5min，移至暗房，将3张X-射线胶片重叠覆盖于膜上曝光10~30s（可根据后面结果调整曝光时间），胶片于显影液90s，清水冲洗，定影液90s，再用清水洗净胶片；根据胶片结果是否清晰，选择是否重新压片。