荧光定量PCR步骤

2.3.2反转录反应2.3.2.1去除基因组DNA反应按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。试剂使用量5×gDNAEraserBμffer2.0μlgDNAEraser1.0μlTotalRNA1μgRNaseFreedH2Oμpto10μl42℃水浴2min，冰上放置。2.3.2.2反转录反应反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装10μl到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。试剂使用量步骤1的反应液10.0μlPrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μlRTPrimerMix1.0μl5×PrimeScriptBμffer24.0μlRNaseFreedH2O4.0μlTotal20μlPCR反应程序，37℃15min，85℃5sec，4℃保温后。用核酸检测仪检测cDNA浓度，保存于-20℃。2.3.3.2RealTimePCR应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem扩增仪的操作方法1)按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量SYBR®PremixExTaqII10μlPCRForwardPrimer0.8μlPCRReversePrimer0.8μlRT反应液Rox0.4μldH2O（灭菌蒸馏水）6μlTotal20μi2)进行RealTimePCR反应。采用两步法PCR反应程序Stage1：预变性Repeat：195℃30秒Stage2：PCR反应Repeat：4095℃5秒60℃30-60秒