细胞工程制药技术

1第八章细胞工程制药技术第一节概述第二节动物细胞工程制药第三节抗体制药第四节植物细胞工程制药2细胞工程的主要内容动植物组织、细胞培养技术细胞融合（细胞杂交）细胞拆合与核移植细胞器移植染色体工程胚胎工程细胞与基因治疗3第一节概述细胞工程：指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论和方法，按照需要和设计，在细胞水平上进行操作，重组细胞结构，改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养新物种的生物工程技术。4核移植技术动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.5黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利1.克隆羊培育过程1997年多利67体细胞核移植技术用于治疗人类疾病8核移植核移植：将一个细胞中的核转移到另一去核的细胞中就是核移植，这是一项相当精细的技术。细胞核移植的三个工作：（a）去掉原有的受精卵细胞核，（b）取得另一个细胞的细胞核，（c）重新植入新的细胞核。9细胞器移植即将细胞器从一个细胞中分离出来移入另一细胞中。目前已对叶绿体和线粒体进行了移植实验。人们已将叶绿体移入鸡卵中，能成活27天，还有10%的光合能力。10染色体片段重组“手术”与分离是指利用物理技术对基因的载体—染色体进行“手术”，使它断裂与片段重组，以至对特定染色体的分离，为生物遗传性状的转移与改造、植物新品种开辟了新途径。用X射线处理，断裂染色体，将染色体上有用的与无用的部分分开，形成片段，再通过易位、重组与选择，获得具有新染色体片断的重组类型。11细胞培养是把这些细胞从体内取出，然后接种在特制的培养容器中，给予必要的生长条件，使它们在体外继续生长与增殖。细胞在体外培养成功的关键取决于两个因素：一是营养，包括糖、氨基酸和维生素等。培养不同的细胞需要不同成分的培养基。二是生长环境，如特定的温度、培养液的酸碱度和无菌条件等。12组织培养是将取自动物或植物体的小块组织转移到该组织能在其中继续生存并发挥功能的人工环境中。被培养的组织可为单个细胞、一群细胞或器官的一部分或整个器官。培养中的细胞可以繁殖，可以改变大小、形态和功能，显示特化的活动或与其他细胞相互作用。13组织培养首先将外植体分离出来，然后在无菌及适当条件下培养以诱导出愈伤组织，另外在愈伤组织随外植体生长一段时间后还需要进行继代培养，以避免代谢产物积累及水分散失等因素的影响。细胞培养可分为悬浮细胞培养、平板培养、饲养层培养和双层滤纸植板等几类方式。14组织培养技术在鉴定感染、酶缺陷、染色体异常，分类脑肿瘤和设计及测验药物和疫苗方面已起了很大作用。将取自孕妇的细胞进行培养，可判定其体内的胎儿是否存在与唐氏综合症有关的染色体缺陷。15细胞融合技术16细胞融合的发展细胞融合是60年代发展起来的一门细胞工程技术，它不仅在基础研究中有重要的作用，而且在植物、微生物的改良，基因治疗、疾病诊治等应用领域中展现着美好的前景。通过细胞融合得到淋巴细胞杂交瘤制备单克隆抗体被誉为免疫学上的一次技术性革命。细胞融合已成为细胞工程中的核心技术。17细胞融合是指指人为地使两种不同的生物细胞在同一培养器中，用无性的人工方法进行直接接触，产生能同时具有两个亲本细胞有益性状的杂交细胞技术。人工方法使两个不同的细胞融合，发生体细胞杂交，形成新的杂种细胞。故有人称融合细胞为杂种细胞。18细胞融合过程可分成两个阶段：①异核体阶段(heterokaryon)：异核体是指在融合细胞内含有来自两个亲本的细胞核。异核体中细胞核尚未融合。②杂种细胞形成：当异核体同步进入有丝分裂后，核膜崩溃，来自两个细胞核的染色体结合在一起。融合细胞内只含有一个细胞核，是由来自两个亲本细胞的基因组组合在一起所形成的。此时的细胞就称为杂种细胞。19发展史1838年Muller第一个描述了脊椎动物肿瘤细胞融合成多核细胞的现象。1907年，体外组织培养技术成功之后，人们观察到体外培养的细胞也能融合而形成多核巨细胞。1958年，日本冈田善雄(Okada)用高浓度的仙台病毒(SendaiVirus)在体外成功地融合了小鼠艾氏腹水癌细胞后，细胞融合技术，得到迅速发展。201960年，法国的Barski等首先发现不同类型的细胞在混合培养过程中自发融合的现象1966年，Yerganian进一步用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。从此，人工诱导细胞融合的方法，即被广泛地用于种内、种间、属间、科间、乃至动、植物之间的杂种细胞的构建，而迅速发展成为一项无论在生物学的基础理论研究，或在工、农、医方面的应用，均具有广阔前景的细胞工程技术。70年代，童第周在我国率先开展了这方面研究。21诱导方式物理法：电融合化学法：PEG融合生物法：灭活的病毒仙台病毒紫外线丧失感染性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）三、细胞融合的方法（常用范围浓度10%-60%，分子量1000-6000）22电融合电融合技术的原理：悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在1－100MHz和100－1000V/cm的交流电场中，会沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。23化学融合化学融合剂：它们主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、二价阳离子载体等。其中则以PEG的使用最为广泛。PEG的作用：1、PEG可能使细胞膜（尤其是有丝分裂的骨髓瘤细胞）的脂类分子的物理结构发生重排，容易被PEG作用打开细胞膜，使细胞融合。2、PEG可能会把细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂质体扦入与膜结合。3、PEG可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。24病毒融合最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类融合剂。灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中最为有效，使用最广。25实例1978年，德国的梅罗帕斯博士向世界宣告，他们已经用细胞融合的方法培育出了薯番茄。所谓薯番茄就是马铃薯和番茄的杂交后代。26第二节动物细胞工程制药一、生产用动物细胞的来源原代细胞：直接来自动物体，如鸡胚细胞。二倍体细胞系：如WI-38，美国从人的正常胚肺中分离的成纤维细胞。可无限传代的转化细胞系：采用病毒如SV40或某些化学试剂如甲基胆蒽处理二倍体细胞；直接从动物的肿瘤组织中分离。如Namalwa,CHO,BHK-21等。经融合和重组的工程细胞系：融合细胞、工程细胞等。许多国家有专门细胞保存机构27二、细胞培养培养条件器材洗清灭菌、水质、酸碱性、渗透压、温度、空气培养基天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水等。合成培养基：BME、MEM、DMEM、HAMF12和RPMI1640等。包含氨基酸、维生素、激素、脂肪酸、无机盐及其它成份培养方法悬浮培养、贴壁培养、悬浮-贴壁培养等28细胞培养过程29小型细胞培养反应器30三、动物细胞药物细胞因子类药物：一组不同种类的调节糖蛋白。担任细胞间的化学传感器，通过与细胞表面特定受体结合来产生作用，从而触发细胞内信号传导活动。激素类药物：由机体的特殊腺体合成和释放，通过循环系统，作用于靶细胞的微量化学信息分子。酶类药物：来源动物细胞的治疗用酶31细胞因子的主要类型32细胞因子产生途径33干扰素34兽用与医用性腺激素35胰岛素36第三节抗体制药37一、单克隆抗体免疫特异性免疫:细胞免疫和体液免疫非特异性免疫:宿主的屏障、吞噬细胞、抗菌物质、炎症反应38抗体抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受到抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。39抗体分子的结构是由二硫键连接起来的约4条多肽链。长的一对称为重链，短的一对称为轻链。氨基端轻链的一半与重链的四分之一的氨基酸组成及排列顺序多变，称为可变区，羧基端轻链的一半和重链的四分之三氨基酸的组成和排列顺序比较恒定，称为恒定区。可变区中，某些特定位置的氨基酸残基显示更大的变异性，是抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，称为互补决定区，决定了免疫球蛋白分子的异种抗原性。40抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)41多克隆抗体由于病原微生物是具有多种抗原决定簇的抗原物质，产生的抗体是多种抗体的混合物，称为多克隆抗体，即针对多种抗原决定簇的抗体。它们在应用过程中经常会出现非特异性交叉反应。42单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯的单克隆细胞系而产生的。由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。43全世界研制成的对病毒、细菌、寄生虫、肿瘤细胞及各种组织细胞、蛋白质、核酸的单克隆抗体有上万种，在医学、生命科学及医药工业的许多领域得到了广泛应用。单抗制品的销售量也不断增加，成为生物制品的主要来源之一。单克隆抗体的应用441、用于临床诊断单克隆抗体检测法，具有特异性高、快速、简便、灵敏等多种优点，因此首先被用来作临床诊断试剂。在体外测定病人血、尿或分泌物中各种特殊蛋白质的含量，以判断机体是否有病、检测治疗效果等。最早用于商品的单抗是妊娠诊断试剂。检测一些受细菌感染血清的诊断试剂、性病以及肿瘤表面抗原一些受细菌感染血清的诊断试剂、性病以及肿瘤表面抗原的诊断试剂，我国已研制出包括乙肝表面抗原、流行性出血热等在内的几十种单抗诊断试剂。452、治疗试剂1983年，美国首次报导一例化疗和放疗均证明无效的淋巴瘤患者在使用单抗治疗后得到痊愈，使单抗作为治疗试剂受到了瞩目的重视。所谓的“生物导弹”：以抗体或抗体分子中的抗原结合部分为载体，将毒素偶联在这种“载体”上，这种分子只与发生癌变的组织或细胞结合，因而它所携带的毒素集中在癌变组织，从而达到特异性杀伤肿瘤的作用。46鼠源性单克隆抗体的改造目前制备的单克隆抗体都是鼠源性的，大量应用与人体时可产生人抗鼠抗体，使其作用和效果都受到严重影响，甚至有毒副作用。改造鼠源性单克隆抗体的目的有两个：一是降低免疫原性，二是降低相对分子量，增加组织穿透能力。人-鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子抗体。47人-鼠嵌合抗体抗体同抗原结合的功能取决于抗体分子的可变区，同种性免疫原性则决定于抗体分子的稳定区。人-鼠嵌合抗体：鼠源性单克隆抗体的可变区基因和人免疫球蛋白的稳定区基因连接起来，在共转染骨髓瘤细胞，就可表达出完整的人-鼠嵌合抗体。48嵌合抗体49改形抗体用鼠源性单克隆抗体的互补决定区序列替换人免疫球蛋白分子中的互补决定区序列，可使人的免疫球蛋白分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。由于抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。最大问题是抗体的亲和力下降，甚至丧失活性。50小分子抗体基因工程的小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的可变区，其相对分子量仅为原抗体的八十分之一到三分之一。正在研制：1、Fab片段抗体，由完整的轻链和重链的可变区加部分恒定区；2、FV抗体，有重链和轻链的可变区组成；3、单链抗体，由重链和轻链的可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白；4、单域抗体，由重链的或轻链的单个可变区组成；5、最小识别单位，由互补决定区构成。51二、杂交瘤技术B淋巴细胞:分泌特异系性抗体，