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JASCOJ-1500圆二色谱仪操作培训----食品科技学院中心实验室唐老师目录1、圆二色谱仪基本原理与应用2、JASCOJ-1500基本组成与附件3、开机与基本操作规程4、数据分析5、关机与试验注意事项1、圆二色谱仪基本原理平面偏振光的电向量E起偏振器自然光的电向量E椭圆偏振光：两束偏振光的振幅(强度)不相同圆二色性(CD)：活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率差值，将传播的左右圆偏振光变成椭圆偏振光。两束互相垂直，振幅相等的平面偏振光，其位相相差1/4波长时，合成圆偏振光。圆二色性(CD)的表示：CD单位转换方法：（椭圆率θ）：mdeg，定义单位，仪器测定直接显示CD图y坐标。MeanresidueellipticityorMolarellipticity(摩尔椭圆率[θ])：单位为deg.cm2.dmol-1，文献中通常都使用根据Beer-Lambertlaw有：θ=[θ].l.c或[θ]=mdeg/(l.c)(c-摩尔浓度)计算出的值最后再乘以1000即可转换为deg.cm2.dmol-1对于蛋白质，使用的是meanresidueellipticity。由于meanresiduemolecularweight=proteinformulaweight/numberofresidues.摩尔圆二色性为摩尔消光系数的差值（deltaepsilon），即：Δε=εLCP-εRCP在分子模拟中通过高斯理论计算CD光谱时，得到的结果通常是以摩尔圆二色性Δε表示。Δε与摩尔椭圆率（molarellipticity）[θ]之间的转换：[θ]=3298.2ΔεCD光谱与ORD光谱：同时产生，包括同样的分子结构信息，光学活性物质分子中的不对称生色团。CD反应光与分子间能量的转换，旋光性则是与分子中电子的运动有关。差异：CD比ORD容易辨别重叠峰，易检测弱吸收带、更容易拟合、能够提供较多意义明确的信息。旋光性(ORD)：光学活性分子对左、右圆偏光的折射率不同，透射光仍然为平面偏振光，但其旋转了一定的角度（旋光度）。圆二色谱仪应用：*蛋白质折叠研究*蛋白质构象研究*DNA/RNA相互作用*酶动力学研究*有机立体化学研究*光化学物质纯度检测*药物量的分析•天然有机化学•生化和大分子•金属复合物化学•医学•农业化学•物理化学•快速扫描实验通过CD光谱可用于分析诸如核酸、蛋白质、多糖等生物大分子光活性物质的空间结构。蛋白质：氨基酸的圆二色性：在可见光区没有吸收，紫外区只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。2、JASCOJ-1500基本组成与附件配置：1）检测器：UV-VIS163-950nmNIR400-1250nm2)光源：氙灯3)气体：高纯N24)多通道测定（CD/HT/Abs…），CD测定范围：±20,200,2000,10000mdeg5)蛋白质二级结构分析软件6)其他附件：变温支架、停流附件等附件1)变温样品支架（-40~130℃）石英比色皿:1、10mm石英比色皿:1、2、5、10mm附件2)固体样品支架与积分球检测器制样工具可做透射法或反射法，压片制样或直接上样3)停流附件注射器：10ml单管路死体积：46ul注射器FlowrateMax:5ml/minMixingRatio:整数倍反应动力学检测4)N2吹扫装置只能用于标准样品支架，用于190nm以下样品测试3、开机与基本操作规程1）开气：打开氮气，调节分压在0.02mPa左右，依据测定波长范围在仪器右侧的流量控制器中调节所需的气体流量。(190nm2L/min;185-190nm5-10L/min;185nm25L/min)2）开机：打开主机电源，使用变温时，需打开水循环电源。或使用停流附件需开启停流附件控制器电源。3)软件：打开电脑主机，双击“spectramanager”图标，进入操作界面，显示J-1500处于Idle状态则表示联机成功。4)测定模式选择：软件界面参数设置：Example:Spectrameasurement参数设置样品测试：SpecifyingMonitoringParameters:对于3D扫描样品测试技巧：a)预先紫外扫描，A2时，测试不准确。适宜的A范围0.6-1。b)控制HT范围在170-700之间，降低HT方法：降低样品浓度、使用短光程长比色皿、增加带宽、注意溶剂效应。HT700时没有足够的光到达检测器，测试结果不准确。狭缝宽太大，HT170可损坏PMT检测器。4、数据分析1）数据类型：2D数据：.jws格式，光谱分析软件以及二级结构分析软件都是需要这种格式数据文件。3D数据：.jwb格式，需根据需要提取2D数据后进行相关分析。2）蛋白质二级结构软件分析：CD单位需为摩尔浓度，故需已知蛋白浓度（mg/ml），氨基酸残基平均分子量（未知时，一般取110）。“蛋白质中20中氨基酸的平均分子质量约为138，但在多数蛋白质中较小的氨基酸占优势，因此平均相对分子质量约为128。又因每形成一个肽键将除去一分子水（相对分子质量18），所以氨基酸残基的平均相对分子质量约为128-18=110。”---王镜岩版《生物化学》第三版上册p1602D数据分析：二级结构分析：打开proteinSecondarystructureestimation软件，打开转换单位后另存的文件数据。3D数据分析：需进行2D数据提取后方可进行有关分析。点击IntervalDataAnalysis软件，打开.jwb格式3D数据文件。5、关机与测试注意事项1）关机程序：关闭软件、关闭电脑和J-1500主机电源、关闭水循环、通气10min后关闭氮气。2）样品架确认：仪器开机前确认安装的是何种样品支架，若是变温支架必须先开循环水才能开机。3）禁止未开气体开机：高压氙灯，使空气在O2变成臭氧，腐蚀光路配件表面。4）比色皿：石英比色皿由于加工过程产生形变可显示圆二色性，故需使用低CD信号的比色皿。比色皿清洗：保证测试重复性。禁止超声清洗，Pierced等专门清洗剂（清洗剂洗后建议用2M）、碱溶液、50%硝酸等。forprotein:近紫外区使用光程长≥5mm的，远紫外区使用1mm-0.1mm。