金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌检查国标法Donna吴•生物分类学•域：细菌域Bacteria•门：厚壁菌门Firmicutes•纲：芽孢杆菌纲Bacilli•目：芽孢杆菌目Bacillales•科：葡萄球菌科Staphylococcaceae•属：葡萄球菌属Staphylococcus•种：金黄色葡萄球菌S.aureus金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)《伯杰氏鉴定手册》P669金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)•黄色葡萄球菌—概述根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)，其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)•球菌，直径为0.8-1.0μm。•排列成葡萄串状，无芽孢，无荚膜。•细胞单个、成对和多于一个平面分裂成不规则的堆团。•有些菌株具有荚膜或粘层。•菌落光滑、低凸、闪光、奶油状、并且有完整的边缘。•化能异养菌，呼吸代谢和发酵代谢。•兼性厌氧菌，在好氧环境下生长最好。•革兰氏阳性菌。•具有高度耐盐性。•最适生长温度35-40°C，最适生长pH7.0-7.4。•3、生化特性：•可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。金黄色葡萄球菌在厌氧条件下分解甘露醇产酸，非致病性菌则无此现象。•许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。•金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)•金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病性当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。肠毒素可耐受100°C煮沸30分钟而不被破坏,它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。•金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：•a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；•b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；•c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；•d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；•e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F五种血清型。•此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。金黄色葡萄球菌的致病性•金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件：•存放温度，在37°C内，温度越高，产毒时间越短；•存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；•食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。金黄色葡萄球菌的致病性来源：中华人民共和国国家标准标准号：GB4789.10-2010金黄色葡萄球菌的检验程序（国标法）检样25g(mL)样品+225mL7.5%氯化钠肉汤（或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤）均质Baird-Parker平板,血平板36℃±1℃18h～24h36℃±1℃血平板18h～24hBaird-Parker平板18h～24h或45h～48h涂片染色血浆凝固酶试验BHI肉汤和营养琼脂小斜面观察溶血36℃±1℃18h～24h报告金黄色葡萄球菌的检验操作步骤样品25g225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤无菌均质杯8000r/min～10000r/min均质1min～2min36℃±1℃18h～24h在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。血平板36℃±1℃培养18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养18h～24h或45h～48h。划线接种10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤：胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供氮源、维生素和生长因子;较高含量的氯化钠提供较高的渗透压，抑制大多数非葡萄球菌的微生物;磷酸氢二钾为缓冲剂;丙酮酸钠促进细菌生长。葡萄糖提供碳源;胰蛋白胨17.0大豆蛋白胨3.0氯化钠100.0磷酸氢二钾2.5丙酮酸钠10.0葡萄糖2.5pH值7.3±0.225℃金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。Baird－Parker琼脂平板：培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色和晕圈。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能抑制其他细菌，促进金黄色葡萄球菌的生长。胰蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母膏1.0g丙酮酸钠10.0g甘氨酸12.0g氯化锂（LiCl·6H2O）5.0g琼脂20.0g蒸馏水950mLpH7.0±0.2选择性培养基在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。血琼脂平板培养基（Medium）•血琼脂平板培养基是一种基础培养基，含有5%的脱纤维血(羊血或兔血)。用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。•金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上呈β溶血。豆粉琼脂（pH7.4～7.6）100mL脱纤维羊血（或兔血）5mL～10mL加热溶化琼脂，冷却至50℃，以无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。※染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5μm～1μm。血浆凝固酶试验血平板Baird-Parker平板接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面挑取可疑菌落36℃±1℃培养18h～24h。新鲜配置兔血浆0.5mL加入BHI培养物0.2mL～0.3mL置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复试验。脑心浸出液肉汤（BHI）:•蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉提供氮源、维生素和生长因子；•葡萄糖可为多种细菌提供能源；•氯化钠维持均衡的渗透压；•磷酸氢二钠为缓冲剂。胰蛋白质胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.5g葡萄糖2.0g牛心浸出液500mLpH7.4±0.2葡萄球菌肠毒素的检验可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B检测葡萄球菌肠毒素。•GB4789.10—2010结果与报告结果判定：可判定为金黄色葡萄球菌。结果报告：在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。第二法金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数典型菌落计数和确认•金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果：a）只有一个稀释度平板的菌落数在20CFU～200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）最低稀释度平板的菌落数小于20CFU且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；c）某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d）某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；以上按公式（1）计算。e）2个连续稀释度的平板菌落数均在20CFU～200CFU之间，按公式（2）计算。从典型菌落中任选5个菌落（小于5个全选），分别做血浆凝固酶试验。•结果计算：•①•②T——样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A——某一稀释度典型菌落的总数；B——某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；C——某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；d——稀释因子。T——样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A1——第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；A2——第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；B1——第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；B2——第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；1.1——计算系数；d——稀释因子（第一稀释度）。•结果与报告•根据Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数，按公式计算，报告每g（mL）样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g(mL)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。第三法金黄色葡萄球菌MPN计数报告结果•计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN检索表（见附录C），报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数，以MPN/g（mL）表示。速冻食品新国标：可限量有金黄色葡萄球菌•对速冻食品中金黄色葡萄球菌超标的争论有了明确答案。前日，卫生部发出通知，今年12月21日起，新国标将正式实施，这意味着，速冻食品中，金黄色葡萄球菌将由不得检出变为限量检出。•此前，三全、思念、湾仔码头等国内知名速冻食品品牌产品，纷纷被检出金黄色葡萄球菌超标，而有品牌公开表示，现行国标，金黄色葡萄球菌是不得检出的，但是当时正在征求意见的新国标里，则可限量检出，如果按照新国标，则产品合格。•而卫生部前日的通知，也明确，食品安全国家标准《速冻面米制品》(GB19295-2011)，将于2011年12月21日起正式施行。卫生部表示，新标准根据致病菌风险评估结果，调整了沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的限量规定，使其更具科学性和合理性。•据悉，新国标适用范围包括了饺子、馄饨、包子、粽子、汤圆等速冻预包装食品。卫生部有关负责人说，在2011年12月21日前，鼓励企业按照新标准组织生产经营。自2011年12月21日起，企业必须按照新标准组织生产经营。《速冻面米制品》（GB19295-2011）•速冻面米制品•以小麦粉、大米、杂粮等谷物为主要原料，或同时配以肉、禽、蛋、水产品、蔬菜、果料、糖、油、调味品等单一或多种配料为馅料，经加工成型（或熟制）、速冻而成的食品。本标准与GB19295—2003相比主要变化如下：——修改了标准名称；——修改了范围；——修改了术语和定义；——取消了酸价、挥发性盐基氮、总砷和黄曲霉毒素B1的限量；——修改了铅的限量；——修改了微生物限量；——删除了附录A。《速冻面米制品》(GB19295-2011）问答