烟草钾转运体基因TPK1的电子克隆及生物信息学分析

中国农业科学2011,44(1):28-35ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2011.01.004收稿日期：2010-06-11；接受日期：2010-09-10基金项目：国家植物生理生化重点实验室开放课题（PPB08008）联系方式：鲁黎明，Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]烟草钾转运体基因TPK1的电子克隆及生物信息学分析鲁黎明1，2（1四川农业大学农学院，成都611134；2植物生理学与生物化学国家重点实验室，北京100193）摘要：【目的】克隆烟草钾吸收转运基因，分析其亲缘关系，并预测其结构、性质与功能，为烟草钾转运体基因的功能研究提供基础。【方法】以利用RACE技术克隆出的烟草钾转运体基因片段的3'端序列为探针，对烟草EST数据库进行搜索，筛选与探针同源性在95％以上的EST序列，再利用DNAStar软件进行拼接。然后，应用多种生物信息学数据库和软件，对获得的烟草钾转运体基因全长cDNA序列进行结构、性质和功能预测。【结果】获得烟草钾转运体基因（TPK1）的cDNA全长。该基因所编码蛋白质的分子量为26.21kD，理论等电点pI为9.72。该蛋白质是一个疏水膜蛋白，包含6个明显的跨膜螺旋拓扑结构，在二级结构中，共包含11个α-螺旋和16个β-折叠。在亚细胞水平，TPK1定位于质体、液泡及内质网上。在氨基酸序列上，TPK1含有信号肽剪切位点及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位点。在功能方面，TPK1包含典型的K+吸收转运功能保守域，并且与主要的高等植物K+吸收转运基因具有较高的同源性。Northern杂交结果显示，TPK1在茎、叶及花器官中均有表达。【结论】成功克隆了烟草K+吸收转运基因TPK1，该基因与K+在烟草内的运输有关，其确切功能有待进一步验证。关键词：烟草；钾转运体基因；生物信息学；Northern杂交InSilicoCloningandBioinformaticAnalysisofTPK1GeneinTobaccoLULi-ming1,2(1CollegeofAgronomy,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611134;2StateKeyLaboratoryofPlantPhysiologyandBiochemistry,Beijing100193)Abstract:【Objective】TheaimofthisstudyistocloneK+transportergeneintobacco,analyzeitsgeneticrelationship,andpredictitsstructure,nature,functionandtoprovideabasisforK+genefunctionstudiesoftobacco.【Method】CloningtobaccoK+transportergenebymeansofthecombinationoflaboratoryworkande-cloningtechniques.UsingtobaccoK+transportergene3'endsequence,clonedbyRACE,asaprobetosearchthetobaccoESTdatabases,filterouttheESTssequenceswiththehomologyof95%oftheprobe,andsplicedthetwosegmentsusingDNAStarsoftware.Then,analyzegenestructureandpropertiesofthefullcDNAsequence,andpredictitsfunctionbyapplyingavarietyofbioinformaticsdatabasesandsoftwares.【Result】AnewtobaccoK+gene(TPK1)withfullcDNAsequencewasfound.Themolecularweightoftheproteinencodedbythisgeneis26.21kD,andthetheoreticalisoelectricpointpIis9.72.TPK1isahydrophobicmembraneprotein,containingsixdistincttransmembranehelixtopologies.Insecondarystructure,atotalof11α-helix,and16β-foldwerefoundinTPK1.Atsubcellularlevel,TPK1proteinlocatedintheplastid,vacuoleandendoplasmicreticulum.Thesignalpeptidesplicesiteandtheserine,threonineandtyrosinekinasephosphorylationsitesinTPK1aminoacidssequencewerefoundaswell.Inthefunction,TPK1proteincontainsatypicalconservedK+uptaketransporterfunctiondomain,andishighlyofhomologytothemajorK+uptaketransportergenesinhigherplants.NorthernblottinganalysisindicatedthatTPK1wasexpressedinroot,stem,leafandflower.【Conclusion】AnewK+transporterTPK1wassuccessfullyclonedintobacco,anditsfunctionmaybeinvolvedinK+transportationintobaccoplants.Therefore,furtherinvestigationstillneededtounderstanditsroleintobaccoK+uptakeandtransportation.Keywords:tobacco;potassiumtransporter;bioinfomatics;Northernblotting1期鲁黎明：烟草钾转运体基因TPK1的电子克隆及生物信息学分析290引言【研究意义】K+是高等植物生长发育所必需的大量元素之一，在植物的生命活动中发挥着十分重要的作用。如催化重要的酶促反应、保持细胞质的电平衡、保持细胞的渗透平衡与维持细胞的膨压等。此外，K+还参与植物的一些重要生理过程，如细胞的伸长、气孔的运动与气体交换、韧皮部溶质的运输、细胞信号的转导以及保持细胞质与液泡中阴阳离子的平衡等[1-3]。烟草是一种重要的经济作物。K+是烟草吸收最多的一种矿质元素，对烟草具有特别重要的意义。烟叶K+的含量是衡量烟叶品质的重要指标之一。烟叶中K+的含量高，能增加烟叶的产量、增强烟草的抗逆性、提高烟草制品的安全性及香吃味等[4]。【前人研究进展】高等植物对钾的吸收积累与在各个器官中的分配，是通过不同的K+转运蛋白来完成的。Anderson等[5]和Sentenac等[6]在1992年分别从拟南芥中克隆出了KAT1与AKT12个K+通道蛋白基因，这是植物中最先进行的K+吸收转运相关基因的克隆。随着对植物K+转运蛋白结构与功能研究的不断深入，到目前为止，已经在高等植物中发现了众多的与K+的吸收和转运相关的蛋白。在水稻、小麦、玉米、大麦、马铃薯、葡萄等作物中克隆并鉴定出一批与K+吸收与转运相关的基因[7]。电子克隆也是一种较为有效的基因克隆方法[8]。目前，采用电子克隆方法，万嗣宝等[9]进行了桃果实磷脂酶Dα基因的克隆。化文平等[10]进行了向日葵异戊烯焦磷酸异构酶基因（ipi）的克隆。孙涌栋等[11]进行了黄瓜CsEXP10的克隆。张华莉等[12]进行了人类TECTB的克隆。陈军方等[13]进行了小麦中雄性不育同源序列的克隆。刘庆坡等[14]进行了水稻线粒体丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆。马海明等[I5]进行了猪CDC16的克隆。【本研究切入点】目前，烟草K+吸收转运相关基因的克隆极少，仅有郭兆奎等[16]从黄花烟草中进行的NKC1的克隆，而从栽培烟草种中进行的相关克隆则无报道。此前，笔者已经成功地克隆到一条烟草K+吸收转运相关基因的3′端的片段。【拟解决的关键问题】本研究通过对烟草EST序列信息数据资源的挖掘，寻找烟草新的K+吸收转运基因，分析其亲缘关系，并对其结构、性质、功能和表达进行预测与分析，为烟草钾转运体基因的功能研究提供借鉴。1材料与方法1.1材料与试剂烟草品种：K326（Nicotianatobacumcv.K326）。DH5α大肠杆菌菌株（E.coli）由国家植物生理生化重点实验室细胞信号转导研究室保存。工具酶与试剂：各种限制性内切酶、dNTP、PyrobestDNA聚合酶等购自TaKaRa公司；TaqplusDNA聚合酶购自鼎国生物技术公司；Oligo(dT)、pGEM-T载体购自Promega公司；SuperscriptⅡ反转录试剂盒系Invitrogen公司产品；氨苄青霉素、β-巯基乙醇及其它常规试剂均为国产试剂；DNAmaker为宝生物及天为时代公司产品；[α-32P]dCTP由北京福瑞生物工程公司生产；探针标记试剂盒RediprimeTMⅡRandomPrimeLabellingSystem由AmershamBiosciences公司生产。PCR引物合成与测序：PCR引物由北京奥科公司、上海生工生物工程服务有限公司和上海Invitrogen公司合成；测序由北京三博及上海Invitrogen公司完成。1.2烟草钾转运体基因3′端序列的获得1.2.1烟草总RNA的提取及cDNA第一链的获得取生长2周龄的烟草幼苗，在液氮中速冻，采用刘薇等[17]的方法，提取烟草的总RNA。然后，以Oligo(dT)为引物，取总RNA5µg，按照cDNA合成试剂盒的操作说明合成cDNA第一链。1.2.2同源片段的扩增与3′RACE通过对同属植物KUP/HAK/KT家族的拟南芥、水稻、大麦和水生植物Cymodoceanodosa的高亲和K+转运体的序列比对、保守域及motif的分析，利用软件CODEHOP[18]，设计1对简并引物，进行同源扩增、测序，并进行BLAST检索，发现所克隆的序列与植物高亲和K+转运体的同源性较高，确定为烟草的K+转运体基因编码的序列。根据同源片段扩增后的测序结果，设计3′RACE正向引物（P1：5′-CTGGGAGGGATCATGCTCAGCATTA-3′）和反向引物（Q0：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3′），采用Lankiewicz等[19]所介绍的3′RACE的方法，对目的基因进行3′端的扩增。反应总体系（20µL）：10×Taqbuffer（Mg2+）2µL，dNTPmixture（2.5mmol·L-1）2µL，P1（10µmol·L-1）1.5µL，Q0（10µmol·L-1）1.5µL，反转录反应液1µL，Taq0.2µL，ddH2O11.8µL。扩增程序为94℃预变性5min，72℃3min；94℃30s，57℃60s，72℃1min30s，35个循环。将扩增片段回收、纯化并测序后，得到长约480bp的DNA序列。经序列比对，证明为该片段的3′端序列。30中国农业科学44卷1.3电子克隆与生物信息学分析利用RACE技术克隆出的烟草钾转运体基因片段的3′端序列为探针，将烟草EST数据库进行BLAST搜索。然后，对与探针同源性在95％以上的EST序列进行分析，再利用DNAStar软件进行拼接，即获得烟草钾转运体基因全长cDNA序列。对上述电子克隆所得序列，应用多种生物信息