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申请代码：C140303受理部门：收件日期：受理编号：解除保护国家自然科学基金申请书(2008版)资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：项目名称：血红素加氧酶-1介导Th17细胞在哮喘气道炎症中的免疫调节作用申请者：夏振炜电话：[phone]依托单位：上海交通大学通讯地址：上海市卢湾区瑞金二路197号邮政编码：200025单位电话：[phone]转82电子邮件：[e-mail]申报日期：2008年1月25日国家自然科学基金委员会国家自然科学基金申请书2008版第2页版本1.003.381基本信息ykKr4oHP申请者信息姓名夏振炜性别男出生年月1963年7月民族汉族学位博士职称研究员主要研究领域气道炎症免疫调节电话[phone]电子邮件[e-mail]传真个人网页工作单位上海交通大学/医学院附属瑞金医院在研项目批准号30570798依托单位信息名称上海交通大学代码20003001联系人张艳电子邮件[e-mail]电话[phone]转82网站地址[在此录入修改]项目基本信息项目名称血红素加氧酶-1介导Th17细胞在哮喘气道炎症中的免疫调节作用资助类别面上项目亚类说明附注说明申请代码C140303:炎症C1705:儿科学基地类别预计研究年限2009年1月—2011年12月研究属性应用基础研究申请经费34.0000万元摘要(限400字)：目前认为支气管哮喘是以Th2分泌的细胞因子所致炎性细胞浸润为主的慢性气道炎症。近年研究发现，一类新的Th细胞亚群-Th17，具有调控Th1和Th2的作用。Th17主要分泌IL-17，迄今发现有6种亚型（IL-17A-F）。在哮喘气道炎症中，IL-17A/F可促发中性粒细胞性炎症，而IL-17E能促进Th2反应，诱导并激发嗜酸性粒细胞性慢性炎症，但具体机制尚未阐明。血红素加氧酶-1（HO-1）是血红素代谢的限速酶，作为保护蛋白，具有抗氧化应激和抗炎作用。课题组最近研究表明HO-1高表达后可明显减轻气道炎症和气道高反应性；预实验显示：经血红素诱导HO-1表达可影响IL-17分泌。因此本课题设想通过Th17培养和构建小鼠哮喘模型，分析血红素干预前后Th17及其分泌的细胞因子IL-17变化，探讨HO-1、Th17和哮喘三者关系，阐明HO-1抗炎作用机制并提供临床防治新思路。关键词(用分号分开，最多5个)血红素加氧酶-1；Th17；白介素-17；哮喘；炎症国家自然科学基金申请书2008版第3页版本1.003.381项目组主要成员（注:项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）1张自力1964-02-01男副教授博士OregonHealthandScienceUniversity（53）[e-mail]课题设计实验指导42钟文伟1974-12-08男主治医师硕士上海交通大学[e-mail]细胞培养细胞因子测定43苏雯1983-03-12女博士生学士上海交通大学[e-mail]动物造模细胞因子测定84王慧英1982-09-15女硕士生学士上海交通大学[e-mail]细胞鉴定与功能检测85须丽清1977-06-01男博士生硕士上海交通大学[e-mail]细胞培养因子测定66李春娥1978-09-09女主治医师硕士上海交通大学[e-mail]实验指导47崔贻芬1957-05-29女技师其他上海交通大学[e-mail]细胞培养68[在此录入修改]9[在此录入修改]总人数高级中级初级博士后博士生硕士生8221021说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。国家自然科学基金申请书2008版第4页版本1.003.381经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费25.90001.科研业务费7.9000（1）测试/计算/分析费3.0000Westernblot、ELISA、Real-TimePCR等测试（2）能源/动力费1.7000水、电、煤费用，按5%计（3）会议费/差旅费2.0000参加国际、国内会议（4）出版物/文献/信息传播费1.2000文献检索、论著发表费（5）其它2.实验材料费18.0000（1）原材料/试剂/药品购置费18.0000质粒构建，T细胞分离纯化柱、分离Kit、试剂盒、Balb/C和DO11.10小鼠（2）其它3.仪器设备费0.0000（1）购置（2）试制4.实验室改装费5.协作费二.国际合作与交流费3.00001.项目组成员出国合作交流2.境外专家来华合作交流3.0000邀请协作者来华交流路费和住宿费三.劳务费3.4000研究生劳务费四.管理费1.7000组织实施费，按5%计合计34.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）5.0000其他经费来源合计5.0000国家自然科学基金申请书2008版第5页版本1.003.381查看报告正文撰写提纲报告正文（一）立项依据与研究内容：1.项目的立项依据支气管哮喘是最常见的呼吸道慢性炎症性疾病之一，随着生活水平不断提高及生活方式西方化，该病呈不断上升趋势，成为危害人类身体健康的主要疾病之一，给社会带来巨大的经济负担。支气管哮喘因长期、反复慢性炎症可导致气道重塑，严重影响肺功能，因此阐明其发病机制并早期、有效的控制哮喘气道炎症是临床与科研丞待解决的问题。支气管哮喘发病机制十分复杂，涉及肺组织中抗原递呈细胞、树突状细胞、T辅助细胞（Thelpcells,Th）和调节性T淋巴细胞（regulatoryTcells,Treg）及其相互作用。目前认为过敏原促进初始Th0细胞向抗原特异性Th2细胞定向分化，建立以Th2细胞占优势的T细胞免疫应答反应，导致Th1/Th2比例失衡。Th2分泌细胞因子如白介素（interleukin,IL）-4、-5和-13等，一方面进一步促进Th0细胞向Th2细胞分化，另一方面作用于B淋巴细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞（eosinophil,EOS），诱发以EOS浸润为主的慢性气道炎症和气道高反应性（哮喘的两个重要特征）。在慢性气道炎症的基础上，又因过敏原暴露及感染等诱因导致中性粒细胞和单核细胞在肺部大量募集，产生大量氧自由基，引起哮喘急性加重[1-3]。而哮喘的反复急性发作和气道慢性炎症持续状态则导致气道结构破坏与修复交替反复，引起平滑肌增生，最终导致气道重塑。但研究发现，一类新的Th细胞亚群－Th17细胞，在哮喘气道炎症的发生发展中起重要作用。Th17细胞是新近提出的一类独立的Th细胞亚群，不同于Th1（分泌IFN-和TNF-）和Th2（分泌IL-4、IL-5和IL-13）细胞，因分泌IL-17而命名，又称为产生IL-17的效应性T淋巴细胞（IL-17producingeffectorTcells）。该类细胞分泌的细胞因子能够趋化中性粒细胞、单核细胞等，促进炎症的发生，在自身免疫性疾病中起着主导作用，故成为目前研究的热点[4-6]。关于Th17细胞的起源、分化尚未明确，目前认为Th17起源于初始Th0细胞，在TGF-β、IL-6的协同作用下分化为Th17细胞[7-9]，其中IL-23对维持并扩增该细胞亚群具有重要作用，而IL-4和IFN-协同作用可抑制Th17分化[4]（图1），新近研究表明IL-27亦可抑制Th17分化[10]。国家自然科学基金申请书2008版第6页版本1.003.381图1Th17细胞分化示意图Th17细胞以CD4+T细胞为主，又称为细胞毒性T细胞抗原8（CTLA-8）[11]，主要通过分泌IL-17发挥作用[4]，其中人IL-17为同源二聚体蛋白，其氨基酸序列与松鼠猴疱疹病毒的开放阅读框（HSVS13）有58%的同源性。迄今IL-17家族已发现6种亚型（IL-17A-F），分泌的IL-17由2个32kDa同源二聚体构成。Th17细胞分泌的IL-17主要为IL-17A和IL-17F（IL-17A/F）。体内IL-17通过与细胞膜上IL-17受体（IL-17R）结合而发挥作用。IL-17R是一种Ⅰ型跨膜蛋白，含864个氨基酸，在气道上皮细胞、人表皮成纤维细胞、人胚肾细胞、B细胞、髓单核细胞、CD56+外周血NK细胞、外周血单个核细胞上均有表达，而IL-17A/F主要与IL-17RA受体结合[4,12]，可激活3条经典MAP激酶信号传导途径，包括ERK1、ERK2、JNK和P38，引起IL-6和IL-8的分泌，从而导致中性粒细胞在局部的募集，包括浸润气道引发哮喘。IL-17还可触发NF-B，导致T细胞增殖，并上调众多炎症介质基因如NOS和IL-1等的表达，亦可促进粒细胞生成因子分泌，导致骨髓、脾脏中粒细胞数量增加[4,12-14]。因而在众多炎症如哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎及实验性自身免疫性脑炎等，IL-17表达显著升高[15]。进一步研究发现，先前认为由Th1细胞造成的免疫性疾病实际由IL-17所致，而且IL-17在过敏性疾病中的作用亦逐渐被认识。因此，IL-17在哮喘中的作用愈来愈受到重视。一方面，IL-17可协同趋化中性粒细国家自然科学基金申请书2008版第7页版本1.003.381胞和单核细胞募集的细胞因子IL-8、GROα、GCP-2和刺激骨髓粒细胞增生的细胞因子IL-6、GSF、GM-CSF和诱导单核细胞的IL-1和TNF-等作用，促进中性粒细胞、单核细胞生成并在肺部募集，增强其功能和生存时间，引起肺部炎症（图2）。研究发现在图2Th17细胞在气道炎症中的作用哮喘急性发作和哮喘职业病，中性粒细胞起了重要作用。因而认为IL-17A/F参与了以中性粒细胞浸润为主的哮喘发生[1,3]。在过敏性哮喘动物模型中，Naruhito等[16]采用分子克隆技术，体外构建小鼠pcDNAmIL-17F质粒，并将其导入OVA致敏小鼠肺组织中，结果发现在OVA激发后支气管肺泡灌洗液（bronchialalveolarlavagefluid，BALF）内中性粒细胞和单核细胞显著增加，小鼠对乙酰胆碱的气道反应性明显增高，粘蛋白基因表达增强；Peter等[17]对OVA致敏小鼠经IL-17抗体干预后发现BALF内中性粒细胞显著减少，提示IL-17A/F参与了由过敏原诱导的气道高反应性。但IL-17A/F对引起气道慢性炎症的主要炎症细胞－EOS则具有相反的作用。研究发现，通过质粒转染诱导IL-17基因在局部高表达或局部给予重组IL-17蛋白后，随着中性粒细胞的增加，EOS并未增加甚至减少，而给予IL-17单克隆抗体后随着局部中性粒细胞的减少，BALF及骨髓中EOS却显著增加，血清及BALF中IL-5显著升高[15-17]。最新研究报道：IL-17E能促进Th2反应，诱导并激发EOS性慢性炎症，因此IL-17E与以EOS浸润为主的气道炎症和气道高反应性密切相关，但Th17是否分泌IL-17E有待进一步明确。在过敏性哮喘患者和动物模型的血、痰液和BALF中，IL-17mRNA与蛋白含量均显著升高。Silvia等[18]采用IL-17R基因剔除小鼠建立哮喘模型，发现IL-17R缺陷小鼠气道炎症明显减轻，BALF中EOS减少，血清抗原特异性IgE水平降低，体外肠系膜淋巴细胞培国家自然科学基金申请书2008版第8页版本1.003.381养并经特异性抗原刺激后IL-5产生减少，提