质谱流式技术简介

1Review质谱流式技术在生物学研究中的应用Abstract作为最普遍使用的单细胞技术之一，流式技术一直在生物学各研究领域都有着广泛的应用。Helios质谱流式细胞仪通过对传统流式技术和质谱技术的整合，彻底解决了荧光串色的问题，并实现了几十个参数的同时测量。其强大的数据获取能力与现代信息生物学的分析手段紧密结合，对生物学多个领域的研究具有重大的推动作用。在血液学领域，它可以对复杂的样品进行精细的免疫分型和信号通路分析；在免疫学的研究中，可以对免疫细胞进行自动分群，并对免疫细胞的功能多态性进行细致分析；在癌症研究领域，它可以对癌症组织进行精细的亚群分析，帮助研究者找到与临床预后密切相关的细胞亚群；在干细胞研究领域，可以深入探讨当前技术下所区分出的干细胞群体的异质性，对于以后干细胞治疗等领域具有重要的指导意义。目录质谱流式在生物学研究中的应用................................................................................................1一、传统流式技术的困局............................................................................................................2二、质谱流式简介.......................................................................................................................31、技术简介.........................................................................................................................32、基本原理.........................................................................................................................33、技术特点.........................................................................................................................4三、质谱流式的应用实例............................................................................................................51、现对复杂样品（骨髓、外周血等）进行精细的表型和信号通路分析..............................52、展现不同免疫细胞之间的内在联系，探索免疫细胞的功能多样性..................................63、对癌症组织的精细分群和功能分析...............................................................................104、干细胞和细胞分化的研究..............................................................................................132一、传统流式技术的困局生物体是由众多不同类型的细胞组成的，这些细胞存在非常大的异质性；一直以来，流式技术是分析复杂细胞群体的重要手段，它可以实现对细胞进行多参数分析，从而区分不同种类的细胞；其所能检测参数的多少，也决定了我们对于所研究群体异质性的了解程度。传统的流式细胞仪，是基于荧光的检测系统，已经发展了40多年，目前在生物学各个研究领域有着广泛的应用；但是，由于不同荧光基团发射光谱的重叠，使得传统流式技术的发展遇到了瓶颈：一方面，传统流式细胞仪的检测通道数量已经很难有质的提升。目前BD最高端的分析型流式细胞仪具有20个检测通道，而实验室常用的通道数量一般少于12个。由于荧光的发射信号具有较长的带宽，流式信号的检测窗口已经非常拥挤，很难容纳新的检测通道。另一方面，发射光谱的重叠会导致通道间的信号之间会相互干扰，当检测较多通道多于8个时，实验设计和补偿计算已经变得相当复杂，使得多参数检测成为了一项复杂、费时的技术性工作，从而限制了它的应用。随着我们对于造血发生、免疫细胞分化成熟、癌细胞转化、干细胞自我更新和分化、诱导多功能干细胞等关键生物学领域的研究逐渐深入，我们需要更清晰的了解细胞群体内部的各种变化，对流式的通道数量和信号质量有了更高的要求。传统的荧光流式细胞仪已经不能完全满足科研的需要，急切需要一种更加高效、易用、可以进行更多参数检测的流式细胞仪用于以后的科学研究。3二、质谱流式技术简介1、技术简介质谱流式通过对传统流式技术和质谱技术的整合，实现了对单细胞进行多参数检测。它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力，是流式细胞技术一个新的发展方向。与传统流式相比，质谱流式主要有两点不同：第一、标签系统的不同，前者主要使用各种荧光基团作为抗体的标签，后者则使用各种金属元素作为标签；第二、检测系统的不同，前者使用激光器和光电倍增管作为检测手段，而后者使用ICP质谱技术作为检测手段。2、基本原理质谱流式原理如下图所示，它采用金属元素标记物（通常是金属元素偶联的特异抗体或者染料）标记细胞表面和内部蛋白，由一个雾化装置将细胞逐个送入ICP-TOF质谱装置中进行检测；质谱检测其可以检测出细胞中各个标签元素的含量，最后，这些数据会被转换为标准的流式数据。43、技术特点与传统流式细胞技术相比，质谱流式技术具有以下优势：1）检测通道数量多质谱流式中配备的ICP-TOF质谱装置具有非常宽的原子量检测范围（75～210Da），因此可以同时检测上百个不同的参数。2）通道间无干扰，无需计算补偿ICP质谱装置具有超高的分辨能力，可以完全区分开用来标记的各种元素（如右图所示）。所以解决了困扰传统流式的“串色”问题，使实验流程得到简化，也节约了样品和试剂。3）金属标签数量多，并具有极低的背景金属标签是通过多聚螯合物实现与抗体的共价偶联，这种金属螯合物与细胞组分的非特异性结合极低，同时选择作为标记的镧系金属，在细胞中的含量基本为零，因此其信号背景极低。目前已经商品化的金属标签有30多种，随着以后技术进步，更多元素可以用来作为标签，其种类会进一步增加。当然，质谱流式在某些方面也存在一些不足，例如由于细胞在分析过程中会被气化，所以质谱流式不能进行分选操作。在实际的使用中可以将质谱流式和传统分选的流式细胞仪结合起来使用，前者起到情报收集分析的作用，后者则根据提供的Marker信息分选到想要的细胞，从而进行后续的分析。5三、质谱流式的应用实例1、现对复杂样品（骨髓、外周血等）进行精细的表型和信号通路分析质谱流式技术可以实现几十个参数的同时测量，可以实现对细胞群体的精细分群，更可以深入细胞内部对信号通路、细胞增殖、细胞周期等进行精细分析。1）对骨髓的分析2011年Nolan一篇文章发表在Science上，他利用CyTOF质谱流式细胞仪同时检测13个表面标志分子以及18个细胞内信号分子的表达水平，对正常人骨髓样品进行了细致的分析。13个表面Marker将人骨髓样品分为约30个的细胞亚群（如左图），在此基础上对信号分子进行研究，可以研究不同亚群细胞对刺激反应的特异性（右图中显示的是在IL-7刺激的情况下，骨髓细胞中pSTAT5水平的改变）。2）对外周血样品的对比分析：2012年8月份，Nolan实验室又利用CyTOF对外周血进行了研究。他们利用七种不同的金属组合对各孔细胞进行“Barcording”标记（以便实现多个样品的混合检测），检测10个细胞表面标记Marker和14个细胞内信号通路分子。6结果如上图中所示，整个PBMC样品被分为7个细胞亚群，同时可以知道在不同处理情况下，各个信号通路分子随时间的变化情况。2、展现不同免疫细胞之间的内在联系，探索免疫细胞的功能多样性免疫学研究涉及到大量不同的细胞类型，而各个细胞类型内部又有相当大的多态性。面对如此复杂的体系，研究者可以利用CyTOF获取大量Marker和信号分子的表达数据后，再用灵活的数据分析手段将其中有用的信息提取出来，从而对研究起到了重要的指导作用。下面一个实例是EvanNewell等利用CyTOF对CD8+T细胞进行精细的功能和表性分析。1）免疫细胞的自动分群我们知道，CD8+T细胞是重要的T细胞亚群，其TCR受体可以识别MHCⅠ类分子，主要负责细胞免疫，清除感染病毒、癌变细胞等等。根据其成熟程度和功能分为：Naïve、Centralmemory(Tcm)、Effectormemory(Tem)、Shortlivedeffectorcells(Tslec)四种类型。在传统的流式分析中，我们需要利用数个Marker组合的散点图才能将四群细胞分开，不容易观察亚群之间的联系。7EvanNewell的团队用质谱流式检测人的CD8+T细胞16个细胞表面Marker和9个细胞内功能标志蛋白（包括各种效应分子等），然后利用主成分分析（PCA）法对数据进行降维处理，从25个Marker数据中解析出PC1、PC2、PC3三个主要因素。在这三个要素组成的坐标系中，CD8+细胞自然的聚集成相互连接的四群细胞。直观的展示了CD8+T细胞成熟过程中所形成的四群细胞，而细胞群之间的过渡也反映了CD8+T细胞成熟过程的连续性。这提示通过对众多参数的检测和分析，我们不但可以实现自动的细胞分群，也可以揭示相关细胞亚群之间的关系。2）展现细胞亚群内部的多态性产生和保持多态性是免疫细胞用来应付多变的体内外各种挑战的法宝。以往的研究主要集中在BCR或TCR受体等分子水平的多态性上，其实免疫细胞本身的功能也存在相当大的多态性。EvanNewell利用CyTOF2为我们展示了细胞功能的多态性。每个细胞都有可能表达（阳性）或者不表达（阴性）某个细胞功能Marker，因此9个细胞功能Marker在细胞中的表达会呈现不同的组合形式，理论上这个数量可以达到29=512种。实际上，这种组合的数量是随着T细胞成熟的过程而变化的。8如上图（左）所示四个阶段的T细胞功能标志蛋白组合数的变化，色块的数量代表组合数的多少，其颜色代表所占的比例。结果提示Effectormemory（Tem）阶段的CD8+T细胞具有最高的功能多样性，而NaïveT细胞和终末分化的短期效应T细胞则具有较低的多样性。这与免疫发生的生物学过程也是吻合的。3）深入研究免疫反应机制不同病毒的感染机制不尽相同，相应的，机体应对的方式也会有所不同。利用病毒肽段-MHC四聚体来可以标记针对不同病毒的T细胞。研究表明，病毒特异的T细胞（用病毒来源的肽段-MHC四聚体来标记）呈现出不同的群体偏好性，而这种偏好性，与病毒的临床表现密切相关。9例如，CMV是慢性感染的，高免疫原性的病毒，针对它的T细胞主要分布在终末的Short-livedeffector和effectormemory两群中；EB病毒虽然是慢性感染，但是免疫原性较弱，针对它的T细胞主要表现为Effectormemory的偏好性；而流感病毒表现为不定期感染，针对它的T细胞分布与前两者都不同。4）结合“Barcoding”技术，用于抗原表位的大规模筛选Barcoding技术是在传统荧光流式技术的一个重要应用，其原理利用多个标签对微球或者细胞进行标记，根据不同组合种类来区分标记物，使流式可以进行加大通量的筛选工作，这一技术已经成功的用于Luminex等主流产品中