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北京索莱宝科技有限公司第1页，共3页Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒说明书货号：CA1630规格：500T保存：-20°C避光干燥保存，一年有效。产品内容：名称规格保存Calcein-AMSolution(2mM)50μL-20°C避光干燥保存PISolution（1.5mM）150μL-20°C避光干燥保存10×AssayBuffer50mL-20℃保存，经常使用可放在4℃保存。产品说明：Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490nm,Em=515nm）。因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein,AM细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535nm,Em=617nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545nm激发，仅可观察到死细胞。本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，单次就200µl细胞悬液进行染色，可以做500次检测。北京索莱宝科技有限公司第2页，共3页使用方法：1.工作液的配制1.11×AssayBuffer（反应缓冲液）的配制从低温冰箱内取出10×AssayBuffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水（dH2O）做10倍稀释以得到1×AssayBuffer。1.21×染色工作液的配制1）先将低温保存的Calcein-AM溶液(2mM)和PI溶液（1.5mM）回到室温20-30min。注意：第一次使用可对母液进行分装，以减少反复冻融次数。2）取5µlCalcein-AM溶液(2mM)和15µlPI溶液（1.5mM）加入5ml1×AssayBuffer，充分混匀。此时得到Calcein-AM的工作液浓度为2μM，PI的工作液浓度为4.5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。注意：由于Calcein-AM的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。2.染色步骤2.1对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞（1000rpm，3min）。对于悬浮细胞，直接离心（1000rpm，3min）收集细胞。2.2去上清，用1×AssayBuffer充分清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。2.3用1×AssayBuffer制备细胞悬液，使其密度为1×105~1×106细胞/ml。2.4取100µl染色工作液加入200µl细胞悬液内，混匀，37℃孵育15min。注意：如果需要，可延长孵育时间至30min。贴壁细胞也可以不消化，直接去除培养基后进行染色，染色时间可调整。2.5荧光显微镜下使用490±10nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。注意：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。a)用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；北京索莱宝科技有限公司第3页，共3页b)用0.1-10µM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。c)用0.1-10µM的Calcein-AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。注意事项：1）由于Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。Calcein-AM工作液必须现配现用。2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。