植物原生质体的分离与纯化

实验9植物原生质体的分离与纯化实验目的：2了解原生质体在植物体细胞遗传学上的意义。1学习植物原生质体的分离和纯化技术；实验原理：植物原生质体即为去除了细胞壁的植物细胞。分离原生质体的基本要求是获得大量的有活力的原生质体。去除细胞壁有两种方法，机械法和酶法。其中酶法是一种温和、有效的方法，但是仅局限于具有初生细胞壁的组织。植物的细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶质和少量的蛋白质和脂类组成的，通常使用纤维素酶和果胶酶的混合酶液来分离原生质体。实验用品：用具：尼龙过滤网（400目）、双层漏斗、吸管、离心管、显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片等。药品：纤维素酶、果胶酶、8%甘露醇盐溶液、20%蔗糖盐溶液等。实验材料：菠菜、油菜等。实验步骤：1取材：选取充分伸展开的幼嫩叶片，冲洗干净。3酶解：去除下表皮的叶片剪成小块，铺于酶液中，充分接触酶液。25~30℃酶解1~1.5小时，期间可晃动培养皿1~2次。4纯化：1）过滤：用双层漏斗将原生质体过滤到离心管中。2）纯化-漂浮法：用比原生质体比重大的20%蔗糖盐溶液经过离心后原生质体漂浮在蔗糖溶液的表面。（还有沉降法）2去下表皮：用镊子将下表皮撕掉，让叶肉细胞暴露，注意不要损伤细胞。过滤后的液体进行500rpm，3min离心，收集原生质体弃上清，沉淀用2ml8%甘露醇盐溶液轻轻悬浮在一新离心管中加入6~8ml的20%蔗糖盐溶液，将原生质体悬浮液轻轻环加在蔗糖盐溶液上面1000rpm，3min离心，漂浮原生质体原生质体在蔗糖溶液上面形成绿环，吸出原生质体置于另一离心管中再加入8%甘露醇盐溶液进行洗涤2~3次5镜检：将原生质体悬浮液滴在载玻片上，轻轻盖上盖玻片，先在低倍镜下找到原生质体，再换成高倍镜仔细观察。实验报告：1画出在显微镜下看到的原生质体的图像；2在整个实验操作过程中需要注意哪些问题？结果与讨论：1预期结果：完整的原生质体形态上是圆球状的，颜色鲜艳，富含细胞质。过滤前的酶解液过滤前的酶解液过滤前的酶解液2讨论：①选择合适的材料是实验成功的首要因素，请问该实验选材时注意什么问题？②酶解时酶液的组成及浓度如何确定？③研究原生质体的意义是什么？