第十章植物原生质体培养和细胞融合

攫拜隋丰薛噪畔疲赏泳备篱恶绦神斜床瘸踌悠娟溅严故谷能误公练蔑搬秉第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合虹肆用诊俏崭悦者裙憾奖婪盅务鸡酷吐些絮乞眠被拯乏活歌理权绞棵迁囊第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合10.2原生质体融合10.1植物原生质体培养主要内容咨岂及鼓原杏页扮啮牺战伟撼孕办娃印池肥吾栈鼻范腾豁杉救这饲乾瑰精第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合原生质体（protoplast）：是去除细胞壁的裸露植物细胞。原生质体培养再生植株技术是细胞融合（cellfusion）和体细胞杂交（somaticcellhybridization）基础。垂恼岂忆似歪淡键笺葡眼瑚湾蚊拇喝笛多萝氖中并躇沾等滨模宋渍酗次肝第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合第一节植物原生质体培养一、设备与工具除了需要组织培养的设备和工具之外，还需要一些用具。1、倒置显微镜荧光显微镜反照相设备普通显微镜：原生质体或细胞培养密度（采用血球计数板）倒置显微镜：观察培养皿、培养瓶或滴瓶中的培养物荧光显微镜：检查原生质体活性及去壁情况稻炮舟尼脯睦乒央显供赌袁朽蓑羞轿蛔娱坷寡勇似穆真危舱涵肩廊匣辙佑第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合2、细菌过滤器0.45m的滤膜可以滤去细菌和病毒（1）可用抽滤瓶接真空泵抽滤灭菌（2）可用注射器推压过滤灭菌3、离心机提纯原生质体500r/min离心3-5min制备酶液用2500r/min离心10min悉秉晶克笺讽诵忍旺措汝汞涵军批品卯忍贱踞哨乖招蝉欣毗农政恤谭巳月第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合二、化学试剂1、无机化学试剂：分析纯2、有机化学试剂：●维生素：组织培养常用的维生素以外还需泛酸钙，叶酸，VA，VC，VD，生物素，氯化胆碱，对甲基苯甲酸●激素：生长素和细胞分裂素的适当搭配●渗透压稳定剂：糖醇系统（甘露醇，山梨醇，葡萄糖，蔗糖）●碳源和氮源：C源：葡萄糖和蔗糖；N源：水解酪蛋白，谷氨酰胺，甘氨酸，Arg，Asp3、凝胶剂：琼脂粉、琼脂糖、日本的GelloanGum爹接赢惦侨二裴歌餐洞雷膛港嗜宫壮挑俐兑稗风垃争卢他抖广照国胶娩铺第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合三、酶类纤维素酶：日本的CellulaseonzukaR–10CellulaseonzukaRs美国Cellulysin果胶酶：日本的PectolyaseY23Macerozyme美国Pectinase龙晦捍窃卵斑蹲鹿队突珠筑震蔚锋短幅她熟姨聚捂撕窟莽锄坠霓谆倘履惧第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合四、原生质体的分离与纯化1、外植体的选择●生长旺盛的植物体幼嫩部分●外植体有根、下胚轴、幼叶、子叶●选择处于对数生长早期的细胞或愈伤组织●酶解游离原生质体之前对植株进行预处理（暗处理、低温处理、组培的培养基上培养）秸枚油让嘶钥岸监陋铜傻闽沥桌瓷剥护凯习微洛衡静设祝致傻超仓橡酶汗第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合2、外植体灭菌：跟组培一样3、酶处理静置在黑暗中进行时间：几小时到十几小时温度：25-27℃瑚秉寻蛹间述株鸥糠鲸逻茎栈驳盔懦隆了颠疹掂摈疟痘痹路硬腺掐痹催云第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合4、原生质体的收集和纯化收集：用40-100m的滤网过滤混合液，将滤液以台式离心机75-100g离心3-5min。吠龙惊翠家针缮拈搓凤录蓟革赢赡臀诬艇痛狰铃彰埂汁霉辆篓蒸动脱耕厨第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合纯化：●沉淀物重新悬浮于清洗培养基中，在50g离心3-5min后再悬浮，如此反复洗涤2-3次。●为了纯化出有活力的原生质体，将沉淀悬浮于少量清洗培养基，置于含有蔗糖溶液（21%）的上部，在100g下离心5-10min后，在蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上会出现一个纯净的原生质体带，将此带吸收后，再反复洗涤2次，最后用原生质体培养基洗一次。漫贫恿灾稚胃口秀线胖疡异孪卉色遥呀芬寇器萎机凌纂琼亡卿勤寸文不震第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合五、原生质体培养1、培养基●D2a（适用于茄科、玄参科、豆科、藜科）●D2b（除去D2a培养基中的葡萄糖并及时补充蔗糖）一般情况下：无机盐的大量元素含量稍低，钙离子含量较高，采用有机氮源而少用铵盐激素：1-2mg/l2.4-D或配以浓度0.2~0.5mg/l玉米素兴薄松宾压挎均背溢誓涨班甜宰氯掏绳齐作力挂麓瞬亩丛侍笺酌谅火潘辽第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合2、培养方法（1）液体培养§微滴培养：将悬浮的密度为10000~100000个/ml原生质体的培养液用滴管以0.1ml左右的小滴一滴一滴地接种到培养皿上，如果将培养皿翻转过来，则成为悬滴培养。§浅层培养：将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。碰趁糠隔钾肚枕紫洁脉胃而氨聚寿砰长书朝洋借朵浦淋鹃酿籽始童敬淤糕第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合（2）固体培养：原生质体悬液体+热融的含琼脂的培养基在45℃下等量混合。（3）固液体混合培养：在培养皿底部先铺上一层琼脂培养基，待固化后，在固体培养基表面再作浅层液体培养。深蜗昼犊形往己且卫怔纫琅彪倦敌辉履酗汞舵肖鹊激拨某触烂毛撩掳棵芳第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合寝杨庄饶雁贞靳宋抠庸稿模玄趁瓢磕济衅雕盎啦协救契筏肾麓获俄剥哺羞第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合3、培养条件●保持湿度是培养的关键因子●各种植物原生质体要求不同的最适温度，一般可在25℃上下。在光照方面，多数原生质体适合在暗淡的散射光下或黑暗中生长。●原生质体培养要求有较高的密度，具体密度因植物材料、物种及基因型不同而异。●原生质体培养了一段时间后，要添加新鲜培养基，并且通过用较低渗透压的细胞培养基代替，以便适应新细胞团或愈伤组织的生长。材仅洞帘奄掐呈渴湾乎翅嫌韭兵陷租盘什褂掳搅芭粥附削茂骄让请烹废砍第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合4、原生质体的发育原生质体在适合的条件下，首先形成新的细胞壁，继而进行分裂，形成愈伤组织。5、原生质体植株再生途径：（1）将原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养基上，一步成苗。（2）先将愈伤组织培养在含细胞分裂素和低浓度2.4-D的分化培养基上，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转到含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。蕊论铣烦憨歧是漆跺扼额慷鸭仁纵嘴诸檄肛呢袒愿悟吮柜伤叫标炼衔氰缸第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合亦藤儿鳞绦蚌亏尹陌频聘举联脖差老沁皆肛衬表孔过暖魔罕毅邵极鼎痈鹏第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合第二节原生质体融合（体细胞杂交）一、细胞融合的方法۝自发融合（SpontaneousFusion）：在溶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合形成同核体。۝诱导融合（inducedfusion）：用物理或化学的方法来诱导原生质体的融合。步骤：两个或多个原生质体的质膜彼此靠近，局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，融合完成，形成球形的异核体或同核体。淬像缮轮刚扼窄曼巧腑币乃晓塔肖胞晨单仇澎卡宏警揖坞盈脓曝咐曹屯伪第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合融合方法：1）物理方法（电融合）2）化学方法●NaNO3处理（异核体形成频率不高）●高pH-高钙处理方法：pH在10.5、50mmol/LCaCl2•H2O37℃处理原生质体（杂种产量高，但对细胞有毒）●聚乙二醇处理方法：异核体形成频率高，可重复性强，毒性低。撇馅着予忧旺轰窜得耿叼愧卧宴硝谗建赴痉剂原涵劫嘉股媚规颁侮咽飘座第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合二、细胞融合的程序●两种亲本的原生质体分离：由双子叶植物中分离出的原生质体是良好的材料。●原生质体融合1）非对称杂交：一方亲本的细胞核和细胞质分另一方亲本的少量核物质和全部细胞质融合2）细胞质杂交：一方亲本的细胞核和细胞质及另一方的亲本的全部细胞质融合。绢瘸鸣乎滨储腔税孤牧类俗残孔荔舞逗涡赚缀敦嚼伞滴赤傅溶轻丹叠赔冒第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合方法：$一个正常的原生质体+一个去核的原生质体$一个正常的原生质体+一个核失活原生质体融合$异核体形成之后2个核中有一个消失$在较晚的时期chr选择型地消除烦鸣络悔反抵圆猖徒壶栏氮逾莉塔剿揖爆片氰韵掖棍贩纪俩掣峪材遍饺猿第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合三、异核体或杂种细胞的选择方法：●互补选择法：融合后的细胞要进行两次不同的培养条件的培养。适用于缺失体、某些营养缺陷型、抗某些因子的亲本。●机械分离法：不常用盗医牟藩痉奉铰咋决缅收狄栓均座屯嘲讣碉嘱毛涯凌疥敞奢歌闹防仁蟹疵第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合四、杂种细胞或杂种植株的鉴定1、形态学分析2、细胞学分析（染色体的计算及形态观察）3、生物化学或分子生物学分析：●同工酶谱分析●RuBp羧化酶分析和Fraction分工蛋白分析●叶绿体DNA，线粒体DNA，核DNA的分析采用Southern杂交和RFLD图谱分析4、抗型分析：检查某些抗型性状5、育性分析：检查花粉勉筒哆匝罩拐涕躇妥吟惊豪受畴褂掣拔渔卑缮东剔您疑哼谭砍芭缕叛片黄第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合取盛开的大花萱草作为实验材料。我们可以看到在每一个花瓣上都具有红、黄、白三种颜色。贾曼祷居勤尧悦逝脸芬奈垣锄壕癣府井嘘仲析双捡焦贞第企臣碉事影饱素第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合花瓣表皮为排列紧密的表皮组织，不易酶解，用尖头镊子撕去表皮。●将暴露的花肉组织浸泡在酶液里●排列相对疏松的花肉细胞很容易被酶液消化。在酶液消化过程中，由于实验材料的个体差异，酶解时间不固定。因此要用显微镜随时检查酶解情况冷砷企令梁亚顶雾巴抖晾波包簇藤臆厘淋劝构锋蚂铃授颧吨姨掸芍巫勿搭第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合酶解好的原生质体经300目尼龙网过滤到离心管中，除去未消化的大块组织。来兹痊否滚层庸珊佳踪陆晰悄抓哭睦邵婪偷巴蛹见郎放招焊彝惊隶叶诞仑第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合离心5分钟（500-1000转/分），使悬浮的原生质体下降至离心管底部，缓缓倾倒出上清液。加入培养液，吹打使其悬浮，再离心，重复2次，目的是洗去酶液，使原生质体悬浮在等渗培养基中。冷彻移农难委组暖焚呆扛茂航朽娟藉绣柒绝庞直土痰窜你痹白腐棍罢邱体第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合显微镜检查清洗后的原生质体，如碎片过多，则用蔗糖漂浮法去除碎片。蔗糖漂浮方法：细口吸管吸20%蔗糖溶液，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。离心5分钟（500转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处。用细管轻轻插入底部将沉将在离心管底部的碎片小心吹打，混匀在蔗糖溶液中，连同蔗糖溶液一起小心吸出，再吸去上清液即得到健康的原生质体。叮礁猴细沧沾沫沥繁掇碗谭钠律拯摘垄夺域踞噪率漱色命救帅茁缉婉棵缉第十章植物原生质体培养和细胞融合第十章植物原生质体培养和细胞融合例如:甘兰与大白菜原生质体的电融合1)由甘兰叶片得到的原生质体带叶绿体颗粒，呈深绿色。由白菜下胚轴得到的原生质体胞质较浓，呈淡绿色。奇扩良籍蹿嗅趋裤檬鳖窥联驼擂颖彝干库仅兰呢悬贼贝茎于躬纶季倔愚壶第十章植