植物组织中可溶性蛋白(MDA)的测定

课程名称：植物生理学及实验实验类型：理论学习实验项目名称：植物组织中可溶性蛋白的测定1.实验目的和要求掌握植物组织可溶性蛋白的测定的理论和技术。2.实验内容和原理2.1.衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最终自然死亡的过程。2.2.衰老时的生理生化变化——蛋白质显著下降,核酸含量的变化、光合速率下降、呼吸速率下降、生物膜结构变化、植物内源激素的变化等。2.3.植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。2.4.自由基代谢失调,并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA3.主要仪器设备分光光度计、离心管、移液枪等。4.操作方法与实验步骤4.1.制备蛋白提取液：称叶龄差异明显的叶片各0.50g，加入5ml磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。4.2.样品的测定：取40ul蛋白提取液+160ul磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。4.3.MDA的测定：1）取上清液1.0ml于7ml离心管中,加TBA与TCA混合液4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92ºC水浴保温30min2）空白管：1mLPi-buffer+TBA与TCA混合液4.0ml92ºC水浴30min）冷却后，平衡，离心5min;10000rpm3）测定A532,A450和A6004.4.计算：1）可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（μg）×提取液体积/（测定加样量×鲜重）2）MDA含量进一步求出单位鲜重植物组织中的MDA含量5.实验数据记录和处理5.1可溶性蛋白：老叶：3972.06(μg/g.FW)；新叶：18328.48(μg/g.FW)分析：说明在叶片衰老的过程中，可溶性蛋白的含量减少。5.2MDA:实验组1实验组2平均值实验组1实验组2平均值OD值（450）0.8080.7770.792±0.0220.30.2410.2705±0.0417OD值（532）0.3220.4450.383±0.0870.0940.0710.0825±0.0162OD值（600）0.0270.020.023±0.0050.0150.010.0125±0.0035老叶新叶老叶：MDA(mM)=（0.383－0.023）÷155=0.002323(mM)=2.323(uM)MDA(uM)=6.45×（0.383－0.023）－0.56×0.792=1.8785(uM)新叶：MDA(mM)=（0.0825－0.0125）÷155=0.0004516(mM)=0.4516(uM)MDA(uM)=6.45×（0.0825－0.0125）－0.56×0.2705=0.3000(uM)分析：MDA(mM)值均高于MDA(uM)值，说明蔗糖等物质确实对MBA-TBA反应有干扰。故采用MDA(uM)值计算单位鲜重植物组织中的MDA含量。可得：老叶MDA含量=0.0939umol•g-1Fw;新叶MDA含量=0.015umol•g-1Fw分析：说明在叶片衰老的过程中，MDA的含量增加。05000100001500020000新叶老叶可溶性蛋白新叶老叶00.050.1新叶老叶MDA新叶老叶6.讨论、心得6.1植物组织中还有一些物质对丙二醛测定（TBA法）干扰较大：丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，故而它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用TBA在酸性条件下加热与MDA反应，生成红棕色的三甲川，三甲川的最大吸收波长在532nm。由于植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，而且糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收，因此测定植物组织中MDA与TBA反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。6.2植物组织中丙二醛的测定实验中，第二次离心的目的何在？因为此时已经加入了TBA溶液，并摇匀，且已经过沸水浴加热，上清液中已混有不少杂质，需再次离心才不会干扰显色反应结果。6.3植物组织中丙二醛测定实验,研磨、离心时为何可以不用冰浴和低温？因为TBA与MDA的反应需要酸性和高温的条件，这样才能在532nm处有最大光吸收。