逆流色谱技术

逆流色谱技术逆流色谱（countercurrentchromatography,CCC）是一种全液态型分配色谱，分离柱为空的聚四氟乙烯管或玻璃管，互不相溶的两相溶剂中的一相在重力或离心力的作用下保留在柱内作为固定相，另一相作为流动相从其中穿过，样品中各组分依据其在两相溶剂中的分配系数差异而得到分离。由于不用固态载体，因而具有以下优点:(1)无不可逆吸附，回收率高；（2）样品不会遭到破坏；（3）溶剂消耗少，比较经济等。目前已用于多种领域的样品分析或制备。逆流色谱起源于最简单的液液分配装置－实验室里常用的分液漏斗。二十世纪30年代初，Jantzen对工业上的混合分离单元首先使用了逆流分配术语，并发展了实验室规模的逆流分配装置。1941年，Martin和Synge设计了一种级联型萃取装置，他们使用多孔固态载体支撑一种液体，而让另一种不互溶的液体通过载体，从而产生了分配色谱。逆流分配法的创始人Craig发明了非连续式的逆流分配（countercurrentdistribution,CCD）装置，并设计了几种CCD仪器用于多种类型物质的分离，这一设计很快被接受，用于天然产物、多肽和其它生物大分子。此法设备复杂，溶剂消耗大、易乳化，分离操作时间长。此后出现的几种液液分配分离装置和仪器都没有根本上的突破，因此均未得到推广用于。日本学者Ito等首先在日本，随后在美国的国家医学科学研究院发现了一种有趣的现象：不互溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小口径管子里能在重力场的作用下实现物质在两相溶剂间的连续分配。而当螺旋管柱在一离心力场内转动时，随着转速的增加，两相溶剂的混合程度，分配效率，管柱的利用率及物质在固定相的保留值也随之增加。如果把待分离样品从管子的入口引入，连续分配传递过程就会在管柱里进行，从而实现连续的液一液分配分离，并由此设计制造了多种逆流色谱仪。各种逆流色谱仪出现的时间仪器发明者年代螺旋管行星式离心色谱螺旋形逆流色谱仪液滴逆流色谱仪旋转和回旋腔室逆流色谱流通型行星式逆流色谱仪连续洗脱型逆流色谱仪倾斜角转子逆流色谱仪慢旋转螺旋管制备型逆流色谱仪水平流通式逆流色谱仪非同步逆流色谱仪高速逆流色谱仪离心液滴逆流色谱仪双向逆流色谱仪多螺旋管逆流色谱仪Ito等Ito和BowmanTanimura等Ito和BowmanIto和BowmanIto和BowmanIto和BowmanIto和BowmanIto和BowmanIto等ItoMurayama等Lee等Ito等19651970197019701971197219751977197819791981198219881988逆流色谱原理逆流色谱是将两相溶剂连续地进行高效率混合和分离，从而提高分配效率，缩短分离时间。它利用了流体力学的两种基本体系来实现固定相对物质的保留：第一种为固定螺旋管的流体静力学平衡体系（hydrostaticequilibriumsystem,HSES）；第二种为转动螺旋管的流体动力学平衡体系（hydrodynamicequilibriumsystem,HDES）。近年来发现的单向性流体动力学平衡体系为逆流色谱技术开拓了一个广阔的应用领域。流体静力学体系a.下相为固定相b.上相为固定相流体静力学平衡体系的基本模型由水平缠绕的固定螺旋管组成。把已平衡的两相溶剂中的下相先注满螺管，然后把上相从螺旋管的一端慢慢注入，那么，上相会推动在第一个螺旋单元里的下相下降，至两相之界面到达螺旋单元的底部；这时，上相就会在浮力的作用下，穿过下相而向上升起，使得每一个单元里保留近一半体积的下相。这一过程在每个螺旋单元里重复进行，使得整个管里形成两相交替分布的状态，即建立了流体静力学平衡。这时如果继续注入上相，那么新注入的上相只会取代原来在各螺旋单元里的上相，而下相仍保留在螺旋单元里。反过来，如以下相作流动相，也可建立上述平衡。建立平衡后，螺旋管每个分配单元中都保留了较大量的固定相，流动相和固定相不断混合、分层。如果从螺旋管入口把样品注入，它就会在每个分配单元中的流动相和固定相之间进行分配，最终按照分配系数的大小从出口端依次流出．假如在每个单元里的分配都能够达到平衡，那么，这个体系的螺旋单元数就是理论塔板数。按照流体静力学体系设计的逆流色谱仪有：液滴逆流色谱仪（DCCC）、离心液滴逆流色谱仪（CDCCC）、旋转腔室逆流色谱仪（RLCCC）、回旋腔室逆流色谱仪（GLCCC）和整体集成流通回路（MIFC）。流体动力学平衡体系流体动力学平衡体系（HDES）的基本模型由水平缠绕的可以绕自身轴线转动的螺旋管组成。与HSES模型相比，明显的差别是螺旋管有一个自转运动，这一简单转动给HDES体系带来了新的特征，涉及到螺旋管内两相溶剂的复杂的流体动力学相互作用。当管子中放入比重为ρ粒子时，它会按管子转动的方向转动。当0＜θ＜π时，粒子的转速比较慢，当π＜θ＜2π时，粒子的转速比较快。总的结果是粒子的转速比管子的转速小，其大小同粒子的形状，大小和比重密切相关。根据这一特性，就能有效地分离大小和比重有差异的不同粒子。物体在旋转螺旋管里的运动状态示意图1．首端；2．玻璃珠；3．铅粒；4．气泡；5尾端．转动螺旋管中两相的状态在这种基本模型的实验中，首先在螺旋管里注满任一相作为固定相，另一相作为移动相从螺旋管的首端泵入。当移动相达到第一个螺旋单元时，两相相互作用，进而建立流体动力学平衡，这时，同管壁亲和性弱的一相被分裂为许多小液滴，它们随管子的转动作同步的转动。当连续泵入移动相时，螺旋管其它单元的平衡不断被破坏，而两相又能通过重新调整，在每一螺旋单元里的相对体积很快建立平衡，直到整个管子都建立稳定的流体动力学平衡状。此后，再泵入移动相就只会取代各个螺旋单元里的移动相，而较大量的固定相仍保留在管柱中。液滴逆流色谱仪DCCC仪器的工作原理示意a.上行方式；b.下行方式1．储液器；2泵；3．样品室；4分离管柱；5．收集器离心式DCCC的工作原理示意图旋转腔室逆流色谱仪示意图回旋腔室逆流色谱示意图－环绕螺旋管离心分离仪同步螺旋管行星式逆流色谱高速逆流色谱高速逆流色谱(HSCCC)是一种液-液色谱分离技术，它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点。由于HSCCC与传统的分离纯化方法相比具有明显的优点，因此己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、天然产物化学、有机合成、环境分析等领域。HSCCC原理HSCCC原理高速旋转提高两相溶剂的萃取频率HSCCC分离流程图HSCCC特点应用范围广溶剂系统的组成及配比可以是无限多的，因而从理论上讲可以适用于任何极性范围内样品的分离，在分离天然化合物方面具有其独到之处。操作简便仪器操作简单；对样品的预处理要求低，一般的粗提物即可进样。回收率高消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失，在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。重现性好分离效率高，分离量较大影响分离效果的因素1.固定相的保留值在逆流色谱中，留在管中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，高保留量将会大大改进峰分离度。（仪器因素和溶剂系统因素）2.转速的影响螺旋管的旋转速度对两相溶剂在流体动力学平衡时的体积比影响很大，从而影响分离效果。3.流速的影响一般情况下，流动相流速越大固定相流失加重；但流速过慢会导致分离时间过长，从而造成对溶剂的浪费。4.温度的影响应用天然产物已知有效成分的分离纯化化学合成物质的分离纯化中药一类、五类新药的开发中药指纹图谱和质量控制研究抗生素的分离纯化天然产物未知有效成分的分离纯化海洋生物活性成分的分离纯化放射性同位素分离多肽和蛋白质等生物大分子分离以及手性分离等应用：决明子活性成分的分离一、初提物的制备粉碎浸泡过滤萃取旋蒸旋蒸浸膏二、两相溶剂的选择溶剂系统不会造成样品的分解或变性各组分在溶剂系统中有合适的分配系数（0.2-2），分离因子最好大于或等于1.5溶剂系统不会干扰样品的检测；为了保证固定相的保留率不低于50%，溶剂系统的分层时间不超过30秒尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理二、两相溶剂的选择经典溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:5:5:5)二、两相溶剂的选择乙酸乙酯:水（1：1）大部分目标化合物集中在上相乙酸乙酯:乙醇:水化合物的分配比得到了改善，但是化合物的分离时间又过长正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:3:5:7)正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:3:6:6)二、两相溶剂的选择正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:3:5:7)正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:3:6:6)固定相：流动相：梯度洗脱三、分离结果纯度（%）回收率(%)橙钝叶决明素(I）97．491．5甲基钝叶决明素(Ⅱ）93．096．7钝叶决明素(Ⅲ）94．893．3大黄素甲醚(IV）96．395．6大黄素(V）95．598．4