高通量药物筛选与创新药物研究--李佳(国家新药筛选中心)

高通量药物筛选与创新药物研究中国科学院上海药物研究所国家新药筛选中心李佳内容•高通量药物筛选：模型建立、化合物制备、自动化、数据处理•我国高通量药物筛选的现状•我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的策略：组合筛选模型体系、分子家族筛选模型体系、化学生物学方法研究活性化合物作用机制•我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的研究实例化合物资源药物发现DRUGDISCOVERY药物开发DRUGDEVELOPMENT1.临床前研究2.临床研究药物候选化合物1.药物先导化合物的发现2.药物先导化合物的结构优化新药研究的两个阶段分子生物学细胞生物学基因组学蛋白组学生物信息学结构生物学计算机辅助药物设计药物化学高通量筛选技术天然产物化学合成组合化学化合物库筛选模型结构优化先导化合物筛选—药物发现的关键环节—高新技术集中的焦点高通量筛选（HTS）运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的活性测试。一般而言，日筛选能力应在10000次以上方可以称为高通量筛选。TheEvolutionofHTS高通量筛选•快速----每天筛选上万药次•微量----筛选样品需要量为微克级•灵敏----准确判断筛选样品的活性和选择性•经济----筛选费用低常规筛选高通量筛选常规筛选和高通量筛选高通量筛选的四个要素样品制备自动化HTS模型建立数据处理要素一：高通量筛选模型建立针对某一特定靶点，设计一种生物活性检测方法并使之适用于高通量筛选。选择高通量筛选的靶点来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理解和发现。根据这些结果，我们可以选择其中关键的生物效应环节进行干预。这些靶点包括受体、酶、激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等。CurrentDrugTargets•MembraneReceptors45%•Enzymes28%•HormonesandFactors11%•IonChannels5%•DNA2%•NuclearReceptors2%•Unknown7%N=483J.Drews,Science(2000)287:1962靶点确证•Expressionphenotype?•Mutant?•Antisensetreatment?•Antibodytreatment?•RNAi?•Knockout/knockin?•Inhibitortreatment?克隆PCR、RT-PCR方法从cDNA文库、EST克隆、组织和细胞的总RNA中得到关键靶基因亚克隆大肠杆菌表达系统酵母表达系统昆虫表达系统大规模表达、纯化、复性，得到纯净重组蛋白时间光吸收NONHONHOSONHONHOOOEtSHONHONHOOEtSSCOOHHOOCNO2O2NSCOOHNO2E412nm=13,600M-1cm-1检测方法的确定、优化及高通量筛选模型的建立分子水平筛选模型建立流程模型设计•体外生化检测–通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、受体、蛋白与蛋白的相互作用等•细胞水平的检测–主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型通过显色反应、荧光、化学发光以及同位素检测技术测量生物反应的终点。体外生化检测体外生化检测均相检测异相检测放射性检测非放射性检测放射性检测非放射性检测SPA微粒SPA微孔板显色反应检测吸收光检测荧光检测微粒方法检测过滤方法检测吸收方法检测沉淀方法检测放射免疫ELISA检测显色反应(Photometry)No2NHRONo2H2N405nm=1.06×104M-1cm-1RSNHR'OOHSNO2CO2HO2NHO2CSSNHR'OSO2NHO2CSNO2CO2H+412nm=1.4×104M-1cm-1HSNHR'OEE显色反应方法检测MetAP活性maxnmH2NNSOMetAPMet+ONHNO2HNONHNO2ProAPH2NNO2NHOHO显色反应方法检测MetAP活性H2NSNHOHSOOROHSNHOHOROHSNO2CO2HO2NHO2CSSNHOROHOMetAPMetSO2NHO2CSNO2CO2H+R=Ph,CH3=412nm荧光强度(FluorescenceIntensity)7-amino-4-methylcoumarinrhodamine110resorufinFluorogenicPeptideSubstrate荧光偏振(FluorescencePolarization)偏振光快速旋转方向随机低的FP信号偏振光旋转减慢，偏振光方向集中在偏振面上强的FP信号生物大分子FPTheoreticalFPBehaviorofaSeriesofFluorescentDyesAsaFunctionofMW尺寸变化生物大分子+生物大分子FP信号增强生物大分子+生物大分子FP信号减弱竞争性结合+FP信号减弱+IMAPProtein-DNABindingFPHTSSer/ThKinaseCompetitiveFPAssay荧光共振能转移(FRET)荧光共振能转移是指供体受激发后不发射出光子而将激发的能量转移到受体的现象。这种方法可检测生理状态下相互作用分子间的距离。产生FRET需要满足三个条件：供体和受体间距离接近（10~100埃）；供体的发射光谱与受体的激发光谱必须有重叠；供体和受体之间迁移偶极子的方向必须平行。FluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)FluorescenceFluorescenceDAEfficientenergytransfer:10–100ÅAbsorbanceWavelengthAbsorbanceWavelengthDonorAcceptor荧光共振能转移在大多数情况下，供体与受体标记的荧光染料是不同的，供体的荧光会因为受体的存在而发生淬灭。一般荧光素和四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine）之间发生50%有效能量转移所需距离为55埃，EDANS和DABCYL之间为33埃，EDANS和荧光素之间为46埃。FRET主要用于淬灭分析或与淬灭相关的分析。Fluorogenic(Quenched)SubstrateEDANS测定EDANS荧光强度DabcylDabcylEDANS蛋白水解酶FRETExampleofuseofFRETinaproteaseassayMatayoshietal.,Science247954(1990)时间分辨荧光共振能传递（TimeResolvedFRET）LANCEAssayforKinaseLANCEAssayforTransferaseandNuclearreceptorLANCEAssayforProteaseandHelicaseAlphaScreenAlphaScreenforPIP3Excitation680nmStreptavidin-coatedDonorBeadsEmission520-620nmGST-taggedPIP3BindingProteinBiotinylatedPI(3,4,5)P3analogO2anti-GSTconjugatedAcceptorBeadsPI(3,4,5)P3PI(4,5)P2ENZYMEATPExcitation680nmStreptavidin-coatedDonorBeadsEmission520-620nmGST-taggedPIP3BindingProteinBiotinylatedPI(3,4,5)P3analogO2anti-GSTconjugatedAcceptorBeadsPI(3,4,5)P3PI(4,5)P2ENZYMEATPAlphaScreenforcAMPDonor-StreptavidinBiotin-cAMPAcceptor-Anti-cAMP520-620nm680nmBRET闪烁亲近检测法(ScintillationProximityAssay,SPA)放射性标记配体与SPA微粒上的生物大分子结合，亲近闪烁产生可检测的光未标记配体不产生亲近闪烁-射线作用与微粒上的闪烁剂发射可检测的光SPA微粒-射线在介质中被消散放射性标记配体FlashPlate-SPAwithoutBeadsBindReceptorOrTargettoPlateRadiolabeledTracerandSampleaddedOnlyboundTracerisMeasured常用的蛋白水解酶检测方法R吸收光或荧光方法检测产物125I用抗生物素链菌素包被的SPA微粒或FlashplatesTM捕获生物素标记组分Fluores加入抗生物素链菌素测定荧光偏振1.2.3.R125IFluoresBiotinBiotinBiotinBiotin蛋白水解酶蛋白水解酶蛋白水解酶R常用的蛋白水解酶检测方法EDANS测定EDANS荧光强度DabcylCY5加入抗生物素链菌素-APC测定从Cy5到APC的共振能量转移4.5.DabcylEDANSBiotinBiotinCY5蛋白水解酶蛋白水解酶常用的激酶检测方法激酶抗生物素链菌素包被的SPA微粒或FlashplatesTM捕获生物素标记组分或磷酸纤维素板捕获磷酸化组分Biotin1.2.+AT33P33PO43-应用铕标记抗磷酸化抗体及抗生物素链菌素-APC进行均相FRET检测+ATPPO43-BiotinBiotinBiotin激酶常用的磷酸酯酶检测方法3.4.33PO43-PO43-+FreePO43-+Free33PO43-抗生物素链菌素包被的SPA微粒或FlashplatesTM捕获生物素标记组分或磷酸纤维素板捕获磷酸化组分应用孔雀绿染料检测游离PO43-磷酸酯酶BiotinBiotinBiotinBiotin磷酸酯酶以酶为靶点以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及以下几个步骤：–确定反应条件（如缓冲液、pH、温度）–天然或合成的底物的确定–酶动力学–信号窗口的评价–对已知抑制剂的反应情况底物转变为产物后，分别使用显色反应、荧光或放射性化学的方法等。适用的靶点不仅包括蛋白酶、激酶和磷酸酯酶，也包括其它酶类，如DNA连接酶和解旋酶。细胞水平检测细胞水平检测均相检测异相检测微生物检测哺乳动物细胞检测存活检测生长/生长抑制检测报告基因检测混合检测细胞毒性和细胞增殖检测双杂交检测报告基因检测放射性检测非放射性检测放射性检测过滤方法检测放射免疫ELISA检测非放射性功能检测荧光成像检测(FLIPR)贴壁细胞或悬浮细胞中Fluo-3的荧光强度，间接反映钙离子的浓度。在FLIPR实验中，可以用96孔或384孔板对多个样品同时检测，测定荧光强度的过程仅需1秒。可进行钙离子内流的动力学检测。FLIPRfunctionalscreeningassayLGTPGDPPLCinositolphosphatesCa2+Fluorescentdye+fluorescentsignal报告基因•报告基因受一个可诱导转录因子的调控，从而响应受体的活动，并指导报告蛋白的合成。•对应不同的细胞株，可有多种报告基因和载体可供选择。常用的有萤火虫荧光素酶(luciferase)、分泌型碱性磷酸酯酶(secretedalakalinephosphatase,SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(chloramiphenicolacetyltransferase,CAT)、-半乳糖苷酶(-galactosidase)、-内酰胺酶和绿色荧光蛋白(GFP)。ReporterGeneBaitProteinBindingDomainPreyProteinActivationDomain•Twohybridproteinsaregeneratedwithtranscriptionfactordomains•Bothfusionsareexpressedinayeastcellthatcarriesareportergenewhoseexpressionisunderthe