影响限制性内切酶活性的因素5

第二章基因工程的酶学基础第一节限制性内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。基本概念及其生物功能特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase）特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase）非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶•按水解断裂核酸分子的方式:•根据作用的核酸底物不同:基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶1、限制-修饰系统2、限制性核酸内切酶的命名和类型3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、影响限制性内切酶活性的因素5、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶限制性内切核酸酶(Restrictionendonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。限制性核酸内切酶概念2.性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保护作用3.功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制大肠杆菌B大肠杆菌Kphageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修饰作用）修饰的phageλ(K)人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。寄主的限制与修饰现象E.O.P成斑率efficiencyofplatingEOP=1限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。（1）限制（Restriction）限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。（3）限制与修饰系统相关的三个基因①hsdR:编码限制性内切酶②hsdM:编码限制性甲基化酶③hsdS:编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰DNA的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株，B株中，1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护.2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点------（修饰）1.大肠杆菌宿主细胞K株，B株，有各自的限制和修饰系统。限制和修饰作用的分子机制3.外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解------（限制）4.由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。5．接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。1、限制-修饰系统2、限制性核酸内切酶的命名和类型3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、影响限制性内切酶活性的因素5、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：限制性内切酶的命名1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示2.如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗药性R质粒3.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。如HindⅡ：d菌株中发现的第二个酶4.所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如R.HindⅢ表示限制性内切酶M.HindⅢ表示相应的甲基化酶实际应用中，R常被省略。EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点双功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源二聚体Mg2+4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+距识别序列下游24-26bp处随机性切割基因工程中使用注：SAM为S－腺苷甲硫氨酸首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。（1）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGCⅠ型限制性内切酶的基本特性如EcoB和EcoK。未甲基化修饰的特异序列。N：表示任何一种核苷酸需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）辅助因子在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位点首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA的来源无关。ABCC’B’A’A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’或Ⅱ型限制性内切酶的基本特性（1）识别位点序列识别位点处。切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端（2）切割位点AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游24-26bp)，但不是对称的回文顺序，且在识别序列旁边一定数目核苷酸的位置切割。反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG在基因工程操作中用途不大。Ⅲ型限制性内切酶的基本特性IV型限制性内切酶新鉴定出来的一类限制酶。只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖－羟甲基化的DNA序列。除EcoKMcrBC外，识别序列尚未确定，目前尚无应用。核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I型内切酶II型内切酶III型内切酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列，旋转对称（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG切割位点在距离识别位点至少1000bp外随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近识别位点3‘端24-26bp处甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是不是基因工程中的用途无用十分有用用处不大1、限制-修饰系统2、限制性核酸内切酶的命名和类型3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、影响限制性内切酶活性的因素5、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶识别序列识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。4bpHpaⅠCCGGHaeⅢGGCC5bpAvaⅡGGWCCEcoRⅡCCWGG6bpBamHⅠGGATTCSmaⅠCCCGGG11bpBg1ⅠGCCNNNNNGGC12bpBstXⅠCCANNNNNNTGC1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。2、这两股DNA链若按同方向阅读（如5’3’），其核苷酸顺序相同。5′···GAATTC···3′3′···CTTAAG···5′特点有二：回文序列：反向重复序列，双链DNA中含有两个结构相同，方向相反的序列5′···GTNAC···3′3′···CANTG···5′Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。切割方式与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端(cohesiveends):因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。平末端(Bluntend):因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。1.5’突出的末端EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C…5’EcoRI37℃5‘…G--C--T--G--OHP--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A—POH--G--C--T--C…5’退火4--7℃5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C…5’2.3’突出的末端PstI等产生的3‘粘性末端5‘…C--T--G--C--A--G…3’3‘…G--A--C--G--T--C…5’PstI37℃5‘…C--T--G--C--A--OHP--G…3’3‘…G--POH--A--C--G--T--C…5’退火4--7℃5‘…C--T--G--C--A--G…3’3‘…G--A--C--G--T--C…5’i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易得多。粘性末端的意义①连接便利ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。③补平成平齐末端B3’末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。A5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。②末端标记3.平头末端PvuII等产生的平头末端5‘…G--C--T--C--A--G--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--G--A--C--C--T--C