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1时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术：1、时间分辨原理：用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。2、时间分辨原子标记物的特点：发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性原子标记与大分子标记物的对比原子标记物大分子标记物标记位点多个,可达20个只有1个对被标记物蛋白活性的影响影响小,基本无影响影响大,经常影响蛋白活性对被标记物空间结构的影响无影响,保证稳定性影响大,造成试剂的不稳定受环境因素的影响影响小影响大,温度影响3、波长分辨：标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光光谱范围较窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。激发与发射光之间有一个较大的STOKES位移，有利于排除非特异荧光的干扰，增强测量的特异性。4、时间分辨：2标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。每一秒名检测样品1000次，取其中不受干扰的400次的均值作为测定值，有利于提高检测的准确性。时间分辨技术取代酶免、放免是免疫检测技术发展的必然趋势！RIA（放免）放射性（125I），对环境和身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消，如整个欧洲仅尚存几个放免试验室。125I半衰期短，导致试剂的有效期短，需每次定标，造成很大的浪费。由于标记物（125I）的不断变化，带来药盒批间、批内较大的变异，标准曲线无法保存备用。ELESA（酶免）灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性、重复性不好。与其它技术的相对优势：（1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的（2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的（3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的3TRF技术与电化学发光的比较时间分辨荧光电化学发光标记物四种原子:Eu,Sm,Te,Dy一种原子:钌多标记技术有无科研项目能(1000多种科研项目)无试剂种类58种临床,24种科研,共82种40种临床,无科研试剂价格低高TRF与化学发光的比较时间分辨荧光化学发光发光效率95%1%重复检测可无数次重复不可重复本底噪声零本底干扰大灵敏级数10-1910-15标记物原子大分子化合物标记位点每个抗体可达20个1个标准曲线稳定达一年以上稳定2到4周多标记有,最多可达四标记无科研开发有无4时间分辨荧光免疫定量分析简介时间分辨荧光分析（TimeresolvedFluoroimmunoassay,TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。解离增强镧元素荧光免疫分析是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+同增强剂中的另一种螯合剂螯形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。乙肝病毒（HBV）标记物的检测方法常用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物，由60年代末70年代初的琼脂扩撒法，依次发展为血凝法→酶联免疫吸附（ELISA）、同位素免疫标记（RIA）→化学发光免疫分析、生物发光、电化学发光免疫标记和80年代中建立的稀土离子荧光标记（时间分辨荧光免疫分析）等不同的检测方法。随着科学的发展和检验技术的进步，其方法每发展一步，乙肝标记物检出的灵敏度和准确性都得到不同的提高。时间分辨荧光免疫分析（TRF）为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪物，以单克隆抗体包被支持物与样品中抗原反应，再加入有铕（EU）标记的抗体，进行反应检测，可大大降低一般同位素和荧光标记受环境干扰缺点，提高了检测的灵敏度和准性，该TRF法检测乙肝病毒标记物较其他方法灵敏度高、特异性好，干扰因素少，TRF为目前检测乙肝病毒标记物最理想的方法。TRF定量检测乙肝病毒“两对半”为临床诊断乙肝提供了新手段，有助于临床客观的分析5HBV感染情况、疗效的观察和转归等情况的分析，至少可对下列情况更具有独特的诊断价值：1、治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。2、治疗后定量间接判断体内病毒数量，有助于疗效的观察。3、怀孕前进行定量测定，有助于选择有利于的怀孕时机。乙肝孕妇进行定量检查，有助于使部分病人得到及时的正确的诊断目前我科已正式开展了乙肝二对半的TRFIA定量分析，其每一项的正常值范围均是由我国卫生部根据美国雅培的标准而制定，其灵敏度，准确度，及精确度都有远远优于一般的ELISA法，乙肝两对半的定量制定将给临床提供一个关于乙肝诊断及疗效，预后判断的更可靠的实验结果。1、极大地提高了检测的灵敏度时间分辨荧光免疫定量技术（TRFIA）检测HbsAg灵敏度可达0.2ng/ml,而酶标（EIASA）检测的灵敏度是2ng/ml,极大地提高检测的灵敏度。因此，在急性乙肝早期能及早检出HbsAg，确证HBV感染，缩短窗口期；其次，可发现低浓度HbsAg携带者；在部分慢性乙肝患者中，由于机体缺乏对HBV包蟆蛋白的免疫应答，HbsAg表达较低，酶标检测可出现HbsAg和HbsAb均阴性的情况，TRF技术则可避免这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。2、能动态观察疗效和监测病情1）定量分析HBsAg和HBsAb的浓度变化，可预见急性乙肝是否处于恢复期。如HBsAg浓度降低，HBsAb浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展；反之，HBsAg浓度处于较高水平或上升趋势，而HBsAb一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。2）定量分析HBeAg和HBeAb的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测HBeAg和HBeAb转换的时期，即表现为HBeAg浓度下降和HBeAb升高的过程。高浓度的HBeAg还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高传染性。高浓度的HBeAb一6方面提示病情好转而在某些时候（如肝功能指标很差）则可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。3）HBcAb浓度的高低可反映病毒感染的状态。高浓度的抗-Hbc提示乙肝性感染，恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持续高浓度。而低浓度的抗-Hbc一般为恢复期或既往感染。4）有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈现进行性变化。3、TRFIA和定量PCR技术可互相补充血清HBV—DNA荧光定量PCR测定可以直接反映血液中病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态。HBV—DNA阴性并不完全代表体内HBV已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体内HBV病毒状态。4、HBsAb的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用HBsAb的定量测定能够对抗体是否真正具有“中和”HBV的免疫力作出正确评价，对乙肝的预防起到监督作用。HBsAb的含量在10mlU/ml以上病人ELISA检测即可呈阳性结果，但并不提示机体都一定具有免疫力，而HBsAb的含量在10—100mlU/ml之间的样本，定性虽为“阳性”，但此时机体对HBV的免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染。只有HBsAb的含量达到100mlU/ml以上时才可确定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量检测，可根据HBsAb的含量判断机体对HBV的免疫状态及乙肝苗的免疫效果。因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。7乙肝两对半定量的临床意义1、乙肝表面抗原（HBsAg）定量能极早地检出HBsAg，确证乙肝感染，几乎能与preSl同时检测出。在乙肝病程中大大缩短了窗口期的时间。由于机体常缺乏对包膜蛋白的免疫应答，HBsAg表达较低，可出现HBsAg、Anti-HBs均阴性的情况，定量检测HBsAg则可避免这些情况的出现。病毒发生变异后，病毒表达量较低，甚至“定性”检测不出抗原。可检测出HBsAg，并极有可能同时检测出HBsAg、Anti-HBs。国内外学者研究表明HBsAg的细胞免疫应答与肝细胞损伤有一定关系。血清中HBsAg含量和病人对HBsAg细胞免疫成反比关系，而肝功能改就则与此种细胞免疫成反比。而定量检测HBsAg是反映这一关系的唯一手段。一般来说，慢性肝炎HBsAgCOI相对恒定：而活动性肝炎HBsAgCOI往往较高且不稳定。2、乙肝表面抗体（Anti-HBs）定量Anti-HBs的定量检测能够地机体是否真正具有“中和”HBV免疫力作为正确评价，避免误误导病人，对乙肝的预防起到监督作用。Anti-HBs含理在10—100IU/L之间的样本，乙肝两对半定性的结果为阳性，但此时机体对HBV并无中和作用，仍有感染HBV的危险。只有定量检测Anti-HBs在100UI/L以上时才具有抵抗HBV入侵的作用。因此，定量检测乙肝两对半对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防具有重要意义。3、乙能e抗原（HBeAg）定量HBeAg是乙肝病毒在肝细胞在繁殖时出现的前C/C基因的产物，经蛋白酶水解后HBe8蛋白质以非颗粒形式分泌入血清中。在急性HBV感染时，血清中可出现HBeAg，但维持可测水平的时间很短暂（数天—数周）。HBeAg阳性一般是提示有大量病毒存在，是急性乙肝恢复期的首选血清学指标。由前C基因突变HBV感染所致的急性或慢性乙肝，始终不出HBeAg，但HBV-DNA进行性复制。HBeAg亦在高COI水平波动。与前者HBeAg阳性慢性乙肝类型中的转换期比较，两对半定性均表现为小三阳，但后者主要表现在高HBeAgCOI值，忽高忽低的ALT值和HBV-DNA始终阳性。4、乙肝e抗体（Anti-HBe定量由HBV野型株感染所引起的急性或慢性乙型肝炎，其自然史分为HBeAg阳性期和Anti-HBe阳性期。定量监测能明确出HBeAg向Anti-HBe换的时期，即表现为HBeAgCOI下降（含量降低）和Anti-HBeCOI下降（含量升高）的过程。因此，Anti-HBe定量与HBeAg定量联合检测对监测HBV感染的病程及药物的疗效观察有很好的实际意义。由前C基因突就株HBV感染所致异型慢性乙肝，由于患者始终不出现HBeAg。因此，长期监测患者Anti-HBe含量对判断其预后和转归具有十分重要的价值。5、乙肝核心抗体（Anti-HBc）定量乙肝病毒由外壳HBsAg和内核HBcAg组成。乙肝病毒感染期间，一般会产生Anti-HBc，在HBcAg出现后即可从血清中检测到。偶尔也有Anti-HBc阴性的HBV感染者，多见于免疫抑制的病人。在乙肝感染康复者HBsAg携带者中，Anti-HBc可长期存在。因此，在特殊人群中开展Anti-HBc筛选试验对预防乙肝的传播有重要参考价值。Anti-HBc定量怀其他HBV试验一同检测有助于乙肝感染的诊断和监测。在其他指标缺乏的情况下（如HBsAg阴性），Anti-HBc定量可能是现存HBV感染的唯一指标。9时间分辨免疫荧光法检测乙型肝炎病毒标志物临床工作中发现少部分经酶联免疫吸附法（ELISA）检测仅乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和抗HBcIgG阳性的患者，病毒含量却很高。为此，采用时间分辨免疫荧光分析法（TRF）对34例此类患者进行乙型肝炎标志物（HBVM）的检查，现将结果报道如下：一、资料与方法1.病例选择：为2002年2月至