时间分辨荧光免疫分析

5-2时间分辨荧光免疫分析郑鹄志西南大学化学化工学院发展历程•1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA•1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A•“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究”获2003年度国家科技进步二等奖一、时间分辨荧光免疫分析特点1.荧光衰减时间长镧系元素荧光衰变时间常见荧光物质荧光寿命荧光物质荧光寿命Eu3+714μs非特异性荧光背景1-10ns人血清白蛋白4.1ns人球蛋白、血红蛋白3.0ns细胞色素C3.5nsFITC4.5ns丹磺酰氯14ns苯胺萘磺酸16ns稀土螯合物104-106ns2.Stokes位移大荧光物质激发波长发射波长Stokes位移Eu-(β-NTA)3340nm613nm273nmSm-(β-NTA)3340nm600nm260nmTb-(PTA)3295nm490/543nm195/248nmDy-(PTA)3295nm573nm278nm镧系元素发射峰窄优点•灵敏度高（10-18mol/孔）•原子标记•多标记技术二、时间分辨荧光免疫分析体系•非均相时间分辨荧光免疫分析•均相时间分辨荧光免疫分析（一）非均相时间分辨荧光免疫分析•时间分辨固相免疫分析•解离增强荧光免疫分析•酶放大免疫分析1.时间分辨固相免疫分析灵敏度一般不高•实例•加拿大CyberFluor的FIAgen系统•Eu3+-BCPDA为标记物2.解离增强分析原理示意图（1）双功能螯合剂•EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物•一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接•近中性时，螯合物足够稳定•酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放•Eu-DTTA应用最广泛（2）增强液增强原理图一般增强百万倍•β-NTA：Eu(β-NTA)3(TOPO)2复合物•TOPO：荧光增强协同剂•TritonX-100：表面活性剂，形成胶束•醋酸：酸性介质（3）酶放大•酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复合物•ALP酶放大免疫分析示意图双标记测定AFP和β-hCGβ-NTA作为螯合剂340nm激发，Eu:615nm,820μs；Sm:643nm,88μs（二）均相免疫分析•基于时间分辨荧光共振能量转移•无需洗涤、分离、加增强液•TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射615nm，供体•APC：别藻蓝蛋白，最大发射665nm，受体•能量转移效率最高的供体/受体对时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图三、时间分辨免疫分析方法•夹心法•竞争法•间接法•捕获法•生物素-亲和素放大法1.夹心法双抗体夹心法双抗原夹心法2.竞争法3.间接法间接法测定HCV抗体4.捕获法捕获法测定抗-CMVIgM5.生物素-亲和素法生物素-亲和素检测PAPP-A四、应用•1.肿瘤标志物检测•2.传染病检测•3.糖尿病检测•4.激素检测•5.细胞活性检测1.肿瘤标志物•AFP测定：双抗体夹心法•固相包被抗体•加入样品或标准品•加入Eu标记抗体•加入增强液•测定荧光•灵敏度：0.17U/ml2.传染病检测•梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法•强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照•阴性对照、阳性对照和样品加入板上，孵育•加入铕标记抗原，孵育•加入增强液，检测荧光•符合中国药品生物制品鉴定所结果3.糖尿病检测•C-肽检测：双抗体夹心法•抗体包被微孔板•加入标准品或样品•加入铕标记抗体•增强液，检测荧光•灵敏度：0.08ng/ml4.激素检测•三碘甲状腺原氨酸（T3）：竞争法•微孔板中加入抗体•标准品或样品、铕标记T3•加入增强液，测定荧光•灵敏度：0.21ng/ml5.细胞活性检测测定细胞活性原理图T：靶细胞E：效应细胞NK细胞活性•靶细胞：K562细胞•加入EuCl3,DTPA,硫酸葡聚糖，4ºC孵育•向靶细胞中加入效应细胞（NK细胞），孵育，离心，测上清荧光•计算比释放率（%）实验释放量−自然释放量最大释放量−自然释放量×100%