酵母人工染色体载体

在基因工程中，外源基因片段难以直接进入受体细胞内，即使采用特定的理化方法将其导入受体细胞，也很难在受体细胞内维持完整行，更不用说大量复制或表达,因此在基因工程中需要用到基因克隆载体。克隆载体实际上是一种具有特定功能的DNA分子，它们将携带外源DNA片段或基因进入受体细胞，并使其在受体细胞中得以维持或表达。目前构建并得以应用的克隆载体数以千计，根据构建克隆载体的DNA来源不同分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、植物病毒载体、动物病毒载体、人工染色体载体等。常规的载体在工作时都是在不影响质粒或噬菌体复制功能的基础上装载外源DNA片段的，同时保持质粒和噬菌体的基本特性。这样一来，这些载体所装载的容量就受到限制。人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。人工染色体载体利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色体的大小媲美。如酵母人工染色体载体，它将酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。由于人工染色体载体模拟了染色体的复制方式，因此能装载较大片段DNA，从40kb到几百kb，甚至超过1000kb。目前常用的人造染色体载体包括：细菌人工染色体载体（BAC）酵母人工染色体载体（YAC）黏粒载体（cosmid）P1人工染色体载体（PAC）酵母人工染色体概念基本功能单位构建工作原理优缺点概念酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome,YAC)是利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，是最早构建成功的人工染色体载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长代时为90min，含16条染色体，其大小为225~1900kb，总计有14×106bp。酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝粒正常功能的所有顺式调控信息，可保证YAC在酵母细胞分裂时向两极运动；2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的rDNA分子的末端，提供端粒形成顺序，可保证YAC末端不被降解和重组，且能够稳定地复制；3.ARS1顺序，来源于酵母第4号染色体，可保证YAC在酵母细胞中自主复制YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN）和两个端粒（TEL）。这些元件能满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。4.SUP4顺序，为酵母细胞Trp-tRNA基因的一个赭石突变抑制基因，其中包含有克隆位点，在发生ade2-赭石突变的宿主细胞中，如果没有外源基因的插入，则突变基因表达受到抑制，受体菌为Ade+，形成白色菌落；当有外源基因插入时，则SUP4表达将被阻断，抑制作用消除，受体菌为Ade-，菌落为红色，从而便于重组子的筛选；5.TRP1和URA3顺序，分别是酵母色氨酸和尿嘧啶营养缺陷型trp1-和ura3-的野生型等位基因，在相应的营养缺陷型酵母细胞中可作为选择标记，如果将YAC转入trp1-和ura3-宿主菌后，则转化子能在选择性培养基上生长6.ori和ampr，分别为质粒pBR322的复制起点和氨苄青霉素抗性基因，可使YAC在大肠杆菌中复制和扩增以及便于筛选7.HIS3顺序。酵母人工染色体载体的构建：将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA的复制起点(ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒就是YAC载体。常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5，其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、EcoRI和NotI位点。工作原理：用BamHΙ酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoRΙ切开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转化到酵母细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA的转载导致抑制基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成红色菌落，而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落为白色。YAC载体的优缺点：优点：1.它的突出优点是可容纳比其他基因载体大得多的外源DNA片段，用于构建人类和高等生物的基因组文库时，可以减少了克隆子的数目2.其基因表达和复制机制在理论上与正常染色体上的基因相似，因此，有助于基因功能的鉴定。2.YAC载体的局限性1.存在嵌合现象。即在单个YAC中的插入片段可能来自2个或多个不同的基因片段，研究表明，嵌合体的比例可以达到10%-50%2.稳定性差，在继代培养时插入片段可能出现重排和丢失等现象。这对染色体物理图谱的构建和基因分离十分不利3.插入片段的分离纯化等难度大4.重组子的转化效率低1.YAC载体在酵母中复制的必需元件包括：2.在酵母人工染色体载体中，下面哪段基因片段中包含克隆位点A.CENB.ARSC.TELD.SUP4