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医学微生物学实验报告一、实验题目：脓汁和粪便标本中病原菌的检测二、实验目的：1、了解细菌生长的基本营养条件。熟悉培养基的种类。掌握培养基制备的原则和一般方法。了解理化因素对细菌的影响。掌握常用的消毒灭菌法和无菌操作技术。2、掌握病原菌的分离与培养方法。了解并比较细菌在固体、半固体及液体培养基上的生长特征。3、掌握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备。掌握革兰氏染色法。熟悉细菌的基本形态。了解细菌的特殊结构。熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用。掌握纸片扩散法。三、实验器材接种环，接种针，酒精灯，脓汁标本1支，粪便标本1支，碘酒棉球1瓶，酒精棉球1瓶，眼科镊子2把，伊红美兰平板，营养琼脂平板；斜面培养培养基，营养肉汤，生理盐水，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张，半固体琼脂培养基，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，药敏试验培养物4个四、方法与步骤4.1实验原理（1）、培养基制备：用人工方法将微生物生长繁殖所需要的多种营养物质，按比例混合配制而成的营养制品，其主要用途是分离培养纯种微生物，传代或保存微生物，鉴别微生物的种属，研究微生物的生理及生化特性。（2）、细菌的分离与培养：细菌学检验，特别是细菌培养必须是无菌操作。细菌的接种技术主要有：平板划线分离法，斜面、液体或半固体培养基接种法。为避免在接种过程中污染环境和空气中的细菌污染培养物，要求在酒精灯旁进行细菌接种。采用一般培养法即需氧培养法，将已接种好的培养基置于37℃恒温箱中培养18～24小时，一般细菌即可在培养基中生长繁殖。（3）、半固体培养基接种法(穿刺接种法)：不同的细菌生长在一定的培养基上往往有不同的特征，因此，培养特征可以作为细菌分类鉴定的重要依据。（4）、细菌个体形态特征的观察：细菌是一类具有细胞壁的单细胞微生物，在一定环境下有相对恒定的形态结构。尽管细菌菌落肉眼可见，但要观察单个细菌细胞，必须借助光学显微镜将其放大900～1000倍在微生物学中主要使用的是油镜。油镜是因为在使用时需要香柏油作介质而得名。细菌菌体在强光下呈透明或半透明，其折光系数与玻璃片相似，在光学显微镜下难以看清楚，所以，必须将细菌制成涂片，固定后，用化学染料使菌体着色，从而和周围背景产生鲜明对比，才能观察到细菌的形态与结构。复染法，即鉴别染色法，是用两种或两种以上染料，可将细菌染成不同的颜色，用于协助鉴别细菌。常用的复染法有革兰氏染色法和抗酸染色法。革兰氏染色法将细菌分成两大类：革兰阳性(G+)菌和革兰阴性(G-)菌。（5）、细菌生化反应鉴定：①血浆凝固酶试验：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔等动物血浆发生凝固，凝固的血浆沉积于菌体表面，阻碍吞噬细胞的吞噬，或即使被吞噬，血浆凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。②糖发酵试验：单糖发酵微量管是只含有一种糖(如葡萄糖、乳糖)的pH7.6的蛋白胨水，并加入一定量的指示剂。接种细菌经培养后，若该菌具有分解该糖的酶，有酸产生时就能使指示剂变色。如指示剂为酸性复红［pH4.2(红色)～6.2(黄色)］，则变成红色；溴甲酚紫［pH5.2(黄色)～6.8(紫色)］则呈黄色。若有气体产生，则微量管内集聚气泡。（6）、细菌血清学鉴定：血清学反应是指抗原抗体在体外的特异性结合反应，可用已知抗原检测未知抗体或用已知抗体检测未知抗原。常见的有凝集反应、沉淀反应、补体结合反应和中和反应等。血清学反应常用于传染病的诊断和微生物菌株的鉴定。将已知的抗体(诊断血清)直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌)混合，在有适当电解质存在条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性，称为直接凝集反应，属定性试验，有玻片法和试管法两种，主要用于检测抗原，如菌种的鉴定与分型、ABO血型鉴定等。（7）、细菌药物敏感性试验：纸片扩散法：是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将含已知浓度的药物滤纸片贴于含有敏感性试验菌的琼脂培养基表面，抗生素就自纸片向平板四周扩散渗透，在抑菌浓度所达范围内敏感菌的生长被抑制而出现抑菌圈，通过比较抗生素浓度与抑菌圈的大小以测定抗生素的抑菌浓度。4.2实验步骤（1）培养基制备的一般程序：①调配→溶化→矫正pH→分装→灭菌→检定→保存。②干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→灭菌→检定→保存。（2）、细菌的分离与培养：①细菌的分离：烧灼灭菌接种环→分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和依红美蓝平板上，各做两份→烧灼接种环上的多余的标本→在平板上划曲线→移动平板依次划五区：从原涂抹部分开始，连续平行划线，每次只划平板的1/4～1/5，划毕后接种环再经火焰灭菌，冷却后用同样方法在平板其余部分划线，每次划线要与前次划线重叠1～3条，共计3～4次(区)→接种环烧灼灭菌→平板倒置，做好标记→37℃培养18-24小时→备用。②细菌纯培养：先观察上述①实验中平板分离出来的菌落→接种环烧灼灭菌→挑选平板上典型的四种单菌落（白色、黄色、紫黑色、粉红色）进行斜面接种纯培养，并做好标记→接种环烧灼灭菌→培养不得超过18小时→保存备用。③液体培养基接种：接种环烧灼灭菌→分别取斜面培养实验中培养得到的四种菌苔适量接种到液体培养基中→接种环烧灼灭菌→35℃培养4-6小时，备用。④半固体培养基接种法(穿刺接种法)：右手握接种针，灭菌冷却后，挑取菌苔少许，垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，可刺达近管底处，但不要达于管底，然后沿原路退出→接种完毕，试管口迅速通过火焰2～3次灭菌，塞好棉塞。接种针烧灼后方可放下→斜面培养基管置于37℃培养过夜。（4）、细菌个体形态特征的观察：①观察细菌在固体培养基上生长特征平板菌落特征细菌在琼脂平板上培养一定时间后，形成菌落。各种细菌菌落都有一定的特点，表现在以下几方面：⒈大小：大(直径约3mm以上)，中(直径约1～3mm)，小(直径约1mm以下)。⒉形状：圆形，卵圆形、假根形、丝状、不规则等。⒊边缘：整齐，锯齿状，波浪状，羽毛状。⒋表面：隆起、平坦、中心凸起、脐形凹陷；光滑或粗糙、湿润或干燥。⒌溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周围呈草绿色、不透明)，溶血(菌落周围出现透明环)⒍色素：一般为无色或灰白色，特殊色素有两类：脂溶性色素(菌落本身着色，培养基不着色)和水溶性色素(菌落及培养基均着色)。⒎斜面菌苔的特征：不同的细菌在斜面培养基上生长，往往也具有一定的特征，表现在生长量、菌苔形状(如线状、念珠状、假根状、薄膜状等)、表面形状、光泽、透明度、颜色等方面。②细菌在液体培养基中生长特征的观察细菌在液体培养基中生长可出现肉眼可见的各种特征，如培养液浑浊或澄清，出现形态不一(如絮状、块状等)的沉淀，或在培养基表面形成菌膜(薄膜、厚膜或仅沿管壁产生一圈菌膜即菌环等)。③细菌在半固体培养基上生长特征的观察不同的细菌经半固体培养基穿刺接种后生长情况不同。能运动的细菌，往往沿穿刺线扩散生长(即有动力)，而使穿刺线周围出现模糊或混浊；不能运动的细菌仅沿穿刺线生长；严格好氧菌仅表面生长，兼性厌氧菌沿整个穿刺线生长。（5）、细菌生化反应鉴定：①细菌涂片制备：取洁净的载玻片一张，用在火焰上烧过的接种环取生理盐水1～2环于玻片上。接种环灭菌后，挑取细菌培养物少许与盐水轻轻磨匀，涂抹成直径1厘米大小的均匀薄膜。临床标本如脓汁、痰、分泌物等可直接涂片→干燥：涂片最好在室温中自然干燥，必要时可将涂片膜面向上，小心间断地在弱火高处略烘，以助水分蒸发，但切勿紧靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后难以检查革兰染色法步骤：固定：手持玻片的一端，标本面朝上，在火焰外层快速地来回通过2～3次，共约2～3秒，使标本固定，即可进行染色→初染：在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液1～2滴，经1分钟后用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水→媒染：加芦戈氏碘液1～2滴，经1分钟后用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，不易脱落→脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色或稍淡紫色为止(约需20～30秒)，立即用细流水将酒精冲掉，并倾去玻片上余水→复染：加稀释复红1～2滴，经30秒～1分钟后用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水。标本凉干后，滴加香柏油，用油镜观察，革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。②糖酵解试验。用接种针分别挑少许紫黑和粉红色的细菌接种到葡萄糖发酵管和乳糖发酵管中。将微量管平放在平皿盖内，在37℃下，培养24小时，观察其产酸产气情况。③五血浆凝固酶试验：取干净玻片一块，用计号笔将玻片分为两格，其中一格加兔血浆1～2滴，另一格加生理盐水1滴→将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌冷却后，取细菌新鲜培养物少许，在生理盐水中研磨混匀成细菌悬液→用灭菌接种环取细菌悬液1环，或挑取细菌培养物少许，在兔血浆中轻轻磨匀→稍待片刻，观察结果→结果判断：先观察生理盐水对照，应呈均匀混浊现象。再观察细菌与兔血浆混合物，若有凝块出现，则为阳性；无凝块出现为阴性。（6）、细菌血清学鉴定：①血浆凝固酶试验。：取二滴兔血浆置于洁净的玻片上→接种环烧灼灭菌→分别用接种环取斜面纯化培养所得到的白色和黄色菌苔与血浆研磨混合→边混匀边观察结果→接种环烧灼灭菌→观察结果。②玻片凝集实验：取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul→用接种环分别取粉红色菌苔，约1～2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀→如上述混合悬液由均匀混浊变为澄清透明，并出现大小不等的乳白色凝集块者即为阳性；如混合物仍呈均匀混浊则为阴性者，可认为阴性。（7）、细菌药物敏感性试验：接种环分别取菌液2环，各自在四个平板上，作平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。37℃18～24小时培养，观察结果。五、结果与讨论（1）细菌分离培养特点：图一脓汁标本分离培养出现黄色和白色两种菌落图二粪便标本分离培养的紫黑色和粉红色菌落（2）斜面培养基接种培养结果图三粉红色菌落斜面接种结果图四紫黑色菌落斜面接种结果（3）、.革兰氏染色后显微镜下的镜检结果：图五粪便标本革兰染色法涂片镜检图六脓汁标本革兰染色法涂片镜检镜检结果：表一革兰染色法镜检结果(4)、细菌生化反应和血清学鉴定结果图七血浆凝固酶试验图八玻片凝固剂试验表二血浆凝固酶和玻片凝集试验结果标本脓汁标本粪便标本菌落颜色黄色白色紫黑色带金属光泽粉红色半透明形态革兰阳性球菌,排列不规则，呈葡萄串状革兰阴性杆菌，散在排列结果典型的葡萄球菌；结合菌落颜色，黄色的是金黄色葡萄球菌，白色的是白色葡萄球菌从形态上不能鉴别是什么细菌实验血浆凝固酶试验玻片凝集试验种类白色球菌（左）+兔血清黄色球菌（右）+兔血清粉红色杆菌+生理盐水（左）粉红色杆菌+福氏志贺菌诊断血清（右）结果白色球菌与兔血清少量凝集（+）黄色球菌与兔血清凝集现象较明显，有明显白色凝集物（++）粉红色菌落的杆菌与生理盐水无反应（-），但与福氏志贺菌诊断血清凝集（+++）图九糖酵解实验，从左至右依次：紫黑色菌苔葡萄糖发酵及乳糖发酵，粉红色菌苔葡萄糖发酵及乳糖发酵图十纸片扩散法从左往右：金黄色、白色、紫黑色、粉红色菌与青霉素、庆大霉素、头孢曲松药敏结果图十一紫黑色菌落菌半固体穿刺实验图十二粉红色菌半固体穿刺实验表三结果汇总（5）、实验讨论实验比较成功，结果符合客观事实。但在平板划线法涂布菌液时用力过猛划破培养基，且一区所占面积较大影响了五区，导致最后培养出来的单菌落较少。以后实验要熟练平板划线法。用油镜（6）注意事项1、在革兰染色的操作当中，所取得菌量不能太多，如果取得太多的菌量会在镜检时看到细菌与细菌之间