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第三章大肠菌群测定一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基(三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在lmJ以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时5．检验程序。见图3-1类的酶，随细菌种类不同而异，可以此来鉴别细菌。乳糖是双糖，细菌分解双糖的酶大多是胞外酶。乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被细菌利用，而半乳糖则需在细胞内转化为葡萄糖后再被利用。糖发酵试验主要是测定细菌分解糖类以后所产生的酸，以培基pH降低(指示剂变色)作为观察结果的指标。图3-I大肠菌群检验程序(=)培养基1．乳糖胆盐发酵培基成分：蛋白胨猪胆盐(或牛，羊胆盐)乳糖．、0．04％溴甲酚紫水溶液蒸馏水’pH7．4制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。20g5g‘1Og25m11000m1校正pH，加入指示剂，分装每管l0ml，附注：双料乳糖胆盐发酵培基除蒸馏水外，其他成分加倍。用途：乳糖发酵试验用。原理：细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内培养24±2小时，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。4．报告。根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每l00ml(g)大肠菌群的最可能数。大肠杆菌等细菌在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培基中产生大量气体，进入倒管中，以便观察。注：常用于供发酵试验的各种糖类、醇类和糖苷类(见表3-1)·2．伊红美蓝琼脂培基成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂17g2％伊红Y溶液20ml0．65％美蓝溶液10ml蒸馏水1000mlpH7.1制法：将蛋l白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，高压灭菌121℃15分钟备用。临用时加入乳糖，并加热溶化琼脂，冷至50一55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。原理：大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者比倒有关。不发酵乳糖的细菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)则为无色菌落。3．乳糖发酵培基成分：蛋白胨20g乳糖10gO．04％溴甲酚紫水溶液25ml蒸馏水1000mlpH7．4制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30ml、10ml或3ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。附注：’(1)双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。(2)30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用．3ml乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。4．蛋白胨水成分：蛋白胨(或胰蛋白胨)20g氯化钠5g蒸馏水1000mlpH7．4表3-1供发酵试验用的糖类、醇类和糖苷类（一）供发酵试验用的各种糖类(二)供发酵试验的各种醇类和糖苷类化学上的分类名称三元醇C3H5(0H)3四元醇C4H6(0H)4五元醇类C5H7(OH)6六元醇类C6H8(OH)8环己六醇(CHOH)6糖苷类甘油glycerol赤丝藻醇erythritol侧金盏花醇adonitol阿拉伯胶醇arabitol甘露醇mannitol卫矛醇dulcitol．山梨醇sorbitol肌醇inositol水杨苷salicin七叶苷aesculin松柏苷coniferlin制法：按上述成分配制，分装小试管，高压灭菌12l℃15分钟．附注：蛋白胨内应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。化学上的分类名称戍糖(C5H10O5)已糖(C6H12O6)双糖类(C12H22O11)兰糖类(C6H10O5)3多糖类(C6H10O5)x阿拉伯糖arabinoSe木糖xylose鼠李糖rhamnose葡萄糖glucosedextrose果糖fructose,levulose甘露糖mannose半乳糖galactose麦芽糖moltose乳糖lactose蔗糖sucrose草搪trehalose纤维二糖cellobiose木蜜糖melibiose棉子糖raffinose落叶松糖melizitose菊糖inulin淀粉starch肝糖glucogen糊精dextrin（玫瑰吲哚)图3-2靛基质的产生及呈色的机理图原理：细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质，与对二甲氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲跺而呈红色(见图3-2)。(三)检验时应注意事项1．检验步序。大肠菌群的检验步序采用三步法(乳糖发酵试验、分离培养和证实试验)。第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经过平板分离和证实试验后，有时可能成为阴性。大量检验数据表明，食品中大肠菌群检验步序的符合率，初发酵与证实试验相差较大，不同食品三步序的符合情况也不一致(见表3-2)，所以在大肠菌群检验步序方面，应结合食品类别、污染情况以及样品中菌相的差异分别予以考虑。在食品检验上，除个别情况外，一般来说，如果平板上有较多典型大肠菌群菌落，革兰氏染色为阴性杆菌，即可做出判定。如平板上典型菌落甚少或均不够典型，则应多挑菌落做证实试验，以免出现假阴性。只做一步初发酵，对表3-2检验步序与检出率的关系种样品名称检出阳性率（B/A）*100%（C/B）*100%类初发酵(A)平板分离(B)复发酵(C)（C/A）*100%食’品羊肉熟肉灌肠生牛奶甜炼乳奶粉醋酱油冰棍．雪糕．冰砖汽水炊具(碗)483298540450163771183l374312109483218540439140744126549312109483215539439100743825846012109lOO73.210097.1685.996.134.784.766.410010010072.199.897.661.396.132.282.461.910010010098.899.810071.410092.797.493.3lOO100合计3306281427278582．596.9某些食品来说，误差是比较大的。这样做，会有相当部分的合格样品被作为不合格样品处理．应予注意。2．抑菌剂。大肠菌群检验中经常使用的抑菌剂有胆盐．洗衣粉、十二烷基硫酸钠．煌绿、龙胆紫，孔雀绿等。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有差误，即可对抑菌作用产生影响；有的抑菌剂当牌号、规格改变时，也可影响抑菌效果，而需重新测定抑菌的有效剂量。这些情况均给抑菌剂的使用带来不利条件．我们曾对胆盐等三种抑菌剂进行大肠菌群检验效果的观察(见表3—3)。目前我国在食注:(一)表示不加抑菌剂：()内数字系％．品大肠菌群检验方面采用胆盐作为抑菌剂，猪、牛、羊三种胆盐对大肠菌群的检验效果，经实验观察无何明显差异，可相互替代。但其他胆盐的检验效果则不一致(见表3—4)，故不宜相互替代。目前由于胆盐不易购买，有的实验室以3号胆盐、混合胆盐、去氧胆酸钠或兔胆盐等代替猪胆盐加入培基中，这会影响大肠菌群酶检验结果，应予注意。在胆盐用量上，实验表明1％、O.5％和0.25%三个剂量无何差异。所以目前乳糖发酵管采用的胆盐剂量(0．5％)是适宜的，在称量时稍有差误，亦不致影响大肠菌群的检出。注：分母表示接种株教，分予表示产气株数．3．挑选菌落。大肠菌群是一群肠道杆菌的总称，大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠杆菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。所以在实际工作中。表3—6茵落形态与检出率的关系注：（）内数字系%为了提高大肠菌群的检出率，应当熟习大肠菌群的菌落色泽和形态。在检验方法中我们选用伊红美蓝平板为分离培基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽，检出率最高；红色、粉色菌落检出率较低。菌落形态的其他方面(如菌落大小、光滑与粗糙、边缘完整情况、隆起情况、湿润与干燥等)虽亦应注意，但不如色泽方面更为重要(见表3—5、3—6)。另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，在实际工作中，由于工作量较大，通常只挑取一个菌落，但影响大肠菌群检出率的因素较多，如食品种类、菌落色泽和形态、细菌种类等，所以只挑一个菌落，由于机率问题，很难避免假阴性的出现，尤其当菌落呈不典型时(见表3一7)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。4．产气量。在糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内存有极微小韵气泡(有时比小米粒还小)，类似这样的情况能否算作产气阳性呢?这是许多食品检验工作者经常遇到的问题。大肠菌群协作组在这方面进行了实验观察。结果表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生小于米粒的气泡。一般来说，产气量与大肠浦群检出率呈正相关，但随样品种类而有不同，有小于米粒的气泡，亦可有阳性检出。另外，对未产气的乳糖发醇管是否均应作阴性处理，根据大量工作实践来看，对这种情譬况应予慎重考虑。在日常工作中，经常可以遇到在初发酵时产酸无气，但复发酵却证实为大肠菌群阳性。有时倒管内虽无气体，但在液面及管壁却可以看到缓缓上浮的小气泡。所以对未产气的乳糖发酵管如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步观察．这种情况的阳性检出率可达半数以上(见表3—8)。5．MPN检索表。最可能数(MPN)是表示样品中活菌密度的估测。MPN检索表(见表3—9)是采用三个稀释度九管法，稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测，较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性，而最高稀释度3管为阴性。如果无法估测样品中的菌数，则应做一定范围的稀释度。这次提供的MPN检索表列出了95％可信限，供使用者参考。（以下的扫描部份没多大意义，到此就不再扫了）二、大肠茵群的卫生学意义大肠菌群是作为粪便污