PCR技术及其应用

任务四PCR技术项目一基因工程及其在食品工业中的应用聚合酶链式反应—PCR技术（PolymeraseChainReaction)一、PCR技术及发展历程二、PCR扩增原理三、PCR操作程序四、PCR的成分五、PCR的条件六、PCR引物设计原则七、PCR技术的应用本节主要内容聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个Eppendof管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。（1）1.PCR的发明PCR发展简史（2）Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。1985年Cetus公司的科学家K.B.Mullis发明了PCR，使Khorana的设想得到实现。其原理类似于DNA的体内复制,Klenow酶催化，PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。（2）TaqDNA聚合酶1988年R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反应中。使PCR自动循环仪成为可能。（3）PCR仪1988年Cetus公司发明自动热循环仪。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年。PCR仪体内DNA的复制DNA聚合酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）SSB解旋酶类引物复习5’3’dNTPMg2+原核细胞DNA的半不连续复制过程复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的延长DNA链终止5´RNA引物3´3´冈崎片段复制起始点PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯1944－）Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循环1988年，Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR技术聚合酶链式反应概念（PCR：PolymeraseChainReaction)聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）又称PCR技术，是在体外酶促作用下扩增特异性DNA片段的技术。一对引物（primer）TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）DNA模板（template）Mg2+（magnesium）(一般将Mg2+加入缓冲液)PCR反应五要素一、PCR技术及发展历程二、PCR扩增原理三、PCR操作程序四、PCR的成分五、PCR的条件六、PCR引物设计原则七、PCR技术的应用本节主要内容加热变性复性复温DNA的变性和复性加热、极端pH、有机试剂等可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链（其原有的特性和活性可以恢复）这称DNA复性,也叫退火。DNA双链解离一半的温度称为解链温度（Tm值）。Tm值范围常在85—95℃，因此，PCR变性温度选择90—95℃，时间1-2minPCR技术的基本原理根据体内细胞DNA半保留复制机理，在微量离心管中,加入适量的缓冲液(含MG2+),模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热聚合酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸若干个循环后,DNA可扩增2n倍每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍.PCR反应基本原理及反应步骤变性95℃退火Tm-5℃延伸72℃反应步骤：高温变性低温退火中温延伸双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’3’3’5’5’3’TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板变性模板模板（template）95oCTGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的3‘端互补。（2）DNA模板与引物复性模板模板ATCTTGAAC5’3’ACGTACGTA5’3’引物引物引物（primer）:40-65oCDNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。（3）DNA链的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’模板模板ATCTTGAAC5’ACGTACGTA5’TaqTaq72oC理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。变性—复性—延伸。1个循环的结果新一轮循环开始DNAelongation温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR仪的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。PCR技术的基本原理根据体内细胞DNA半保留复制机理，在微量离心管中,加入适量的缓冲液,模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热聚合酶,一对合成的DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸若干个循环后,DNA可扩增2n倍每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍.PCR反应曲线目的DNA的指数扩增并不是一个无限制的过程。通常经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”，产物的量不再增加。“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能，模板DNA的拷贝数，底物dNTP浓度及多种因素。一、PCR技术及发展历程二、PCR扩增原理三、PCR操作程序四、PCR的成分五、PCR的条件六、PCR引物设计原则七、PCR技术的应用本节主要内容通常进行PCR主要考虑反应体系、反应参数和DNA变性时间与终延伸时间三个方面内容三、PCR操作程序1、反应体系2、反应参数3、DNA变性时间与终延伸时间4、PCR产物的分析标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应体系的总体积依试验要求而定反应参数PCR参数包括循环中三阶段的温度及持续时间控制，以及循环的次数，这在一定程度上影响着聚合酶链式反应的成功与否。通常PCR反应所采取的反应参数为：变性温度95℃60s退火温度38-65℃60s延伸温度72℃1-2s循环次数30_35次复性温度决定与所用引物的长短与碱基组成，一般需要通过实验来确定。DNA变性时间与终延伸时间为了使模板DNA双链充分打开，开始时模板DNA变性要适当延长，一般设预变性94℃3_5min。一般在扩增完成后，PCR产物中可能含有长短不一的分子，都需要一步长时间的延伸反应，称为终延伸，时间要保持在10min左右，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。反应终止后，可以放到4℃中保存，以备电泳检测。经典循环参数（500bp以内）95℃变性60s55℃退火60s72℃延伸1-2min94℃预变性5min×30-35次72℃终延伸7min4℃Hold4、PCR产物的分析取5ulPCR产物,通过凝胶电泳可以大致判断产物纯度，或进行基因测序一、PCR技术及发展历程二、PCR扩增原理三、PCR操作程序四、PCR的成分五、PCR的条件六、PCR引物设计原则七、PCR技术的应用本节主要内容引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）缓冲液四、PCR反应的成分（一）引物PCR中注意所用的引物浓度一般20—200pmol,这种浓度通常足以保证进行30轮以上的扩增。引物浓度偏高，会引起错配和非特异性产物的扩增，同时增加生成引物二聚体的几率。相反，如引物浓度不足，则聚合酶链式反应的效率极低引物是与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA。3’3’（二）DNA聚合酶耐高温的TaqDNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断，PCR技术才进入实用阶段。TaqDNA聚合酶特点①热稳定性最适温度：75oC，延伸温度选择72℃②Taq酶的功能缺点具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3‘5’外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！③TaqDNA聚合酶对Mg2+敏感dNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。（三）三磷酸脱氧核苷酸dNTPs浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率。一般商品化供应的dNTP溶液pH为7.0，各dNTP的浓度为2.5mmol/L,一般使用浓度控制在20-200umol/L。四种各dNTP分子浓度必须相等，以减少错配。（四）Mg2+的浓度Mg2+浓度太高会增加非特异产物（杂带）。镁离子浓度对PCR反应影响很大，既影响到TaqDNA聚合酶的活性和真实性，又影响到引物退火、模板和PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体生成等。PCR体系中的酶离子浓度在0.5~2.5mol/L。（五）模板PCR的模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子；可以是线状分子，也可以是环状分子，不过线状分子比环状分子的扩增效果稍好。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。PCR对模板DNA的纯度要求不高。但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。模板的量不能太多，100l反应体系中100ng足够。过多引起非特异性产物。一、PCR技术及发展历程二、PCR扩增原理三、PCR操作程序四、PCR的成分五、PCR的条件六、PCR引物设计原则七、PCR技术的应用本节主要内容五、PCR的条件（一）变性的时间和温度模板DNA和PCR产物的变性不充分是PCR失败的重要原因。一般在第一轮循环前先进行94℃预变性3~10min，以便使模板DNA完全解链，然后加入TaqDNA聚合酶趁热启动，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性而引起的非特异性扩增。（二）引物的退火引物的退火温度和所需时间长短取决于反应体系中扩增的基因组成及引物的长度、浓度和碱基组成。实际使用的退火温度要比引物的Tm低5℃。退火温度在55~72℃之间都会得到好的结果。一般当引物中G+C含量高、长度较长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。当然，退火温度不能过高，否则引物不能与模板很好得结合，得不到扩增产物。退火通常需要30~60s。（三）延伸时间和温度延伸的时间长短取决于目的序列的长度、浓度及延伸温度的高低。一般引物延伸是在72℃下进行。对2Kb长的产品扩增时间多采用1min（72℃）。（四）平台效应引起平台效应的因素：（1）dNTP或引物等消耗殆尽（2）酶活性逐渐降低（3）最终产物的阻化作用（焦磷酸盐、双链DNA）（4）非特异性产物或引物的二聚体与反应模板的竞争作用（5）浓度在10-8mol/L时的特异引物的重退火（延伸率降低，TapDNA聚合