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第十章第二节微生物在发酵工业中的应用一、微生物发酵与发酵工程•发酵：（原始概念）指从液体中向外冒气泡的现象。•（广义概念）指发酵工业上应用微生物生产某种产品的过程，包括好氧过程和厌氧过程。•（在生物化学中）指有机物脱下的氢直接交给另一内源有机物的过程。发酵工程技术：是大规模工业化应用的技术，最终目标是获得产物或产品，是发酵工艺学和工程学相结合的产物。•发酵工程菌种的选育最佳发酵条件的选定和控制生化反应器的设计发酵产品的分离和精制天然发酵：利用自然环境中存在的多种微生物进行发酵，一般为混合发酵。纯培养发酵：指利用已知菌种进行的发酵，现代工业发酵大多数采用纯培养发酵。纯培养发酵提高了产品的稳定性，被认为是发酵工业的第一个转折点。发酵工程的运用医药工业：抗生素、维生素、胰岛素、疫苗、干扰素等食品工业：氨基酸、新糖原、饮料、酒类、食品添加剂等能源工业：生产乙醇、沼气等化学工业：生产化工原料如乙醇、丙酮、生物表面活性剂等冶金工业：黄金开采和铜、铀等金属的浸提农、牧业：生物固氮、生物杀虫剂和微生物饲料的生产等环境保护：对污染物进行降解和转化等发酵固体发酵：指发酵原料、菌体吸附在固体支持物（载体）上，通过微生物的代谢活动将原料转化为发酵产品。液体发酵：微生物的菌体或菌丝均匀分散在液体培养基中，通过向培养液强制通气进行发酵。发酵基本过程示意图：二、发酵罐•广义发酵罐指为一个特定生物化学过程的操作提供良好而满意环境的容器，工业发酵中指进行微生物深层培养的设备。•发酵（按微生物生长）厌氧发酵罐好氧发酵罐（按发酵罐设备特点）机械搅拌通风发酵罐非机械搅拌通风发酵罐发酵罐一般所具有严密的结构良好的液体混合性能高的传质和传热速率灵敏的检测控制仪表发酵的基本过程菌种培养与扩大（一般需要经过斜面培养、三角摇瓶和小型发酵罐的活化与放大）培养基和发酵设备的灭菌（主要采用蒸汽灭菌，因为蒸汽具有强大的穿透力，破坏菌体蛋白和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡。）发酵过程控制（受很多环境条件的影响，如培养基组成、pH、温度、氧气、泡沫、杂菌污染和噬菌体感染等因素）下游加工过程（是从发酵液中分离、精制有关产品的过程。一般包括发酵液预处理和固体分离）培养基的灭菌分批灭菌：培养基和发酵罐一起灭菌连续灭菌：培养基在发酵罐外灭菌后经过冷却后送人发酵罐优点：高温快速灭菌，发酵罐利用率高，热能利用合理，自动化控制缺点：不适合黏度大或固型物含量高的培养基，增加操作环节，增加染菌机会空气除菌主要通过加入灭菌、静电除菌和介质过滤除菌等方式•pH影响微生物生长繁殖和代谢积累，还影响酶活性，影响膜的通透性，影响微生物营养吸收及代谢产物分泌，影响营养物质的分解或中间代谢产物解离，影响微生物对这些物质的利用。•温度控制要考虑菌体生长和产物形成两个方面。前期控制温度，使其适合微生物菌体的生长繁殖，后期控制温度，使其适合产物的形成。•泡沫中的空气有隔热作用，造成培养基灭菌不彻底，有时从排气口溢出，容易污染。•杂菌污染可导致发酵产物复杂，有毒物质产生，产物分离、提纯困难，严重时导致发酵失败。要经常检查菌种、设备等。•噬菌体是细菌的病毒，噬菌体可侵染发酵菌种，造成发酵菌种的裂解，导致发酵失败。四、微生物发酵的应用乙醇发酵•1，白酒酿造•⑴原料：①糖质原料——甘蔗、废糖蜜•②淀粉原料——高粱、玉米、马铃薯•③纤维素原料——木屑、作物秸秆、甘蔗渣•⑵基本原理：利用霉菌、细菌等微生物产生的淀粉酶、纤维素酶将原料中的淀粉、纤维素等转化为葡萄糖，在酵母菌作用下通过EMP途径将1分子的葡萄糖转化为2分子的乙醇。2、啤酒发酵•⑴原料：以大麦为主•⑵原理:利用大麦发芽时产生的淀粉酶将原料中的淀粉转化为葡萄糖，然后利用酵母菌进行乙醇发酵。•酒花：增加啤酒的香味和爽口苦味，同时具有澄清和防腐的作用。•⑶发酵完成后，还要经过过滤，以去除酵母菌体。•⑷分类：①熟啤酒：经过巴斯德消毒后的啤酒；•②生啤酒：不经过巴斯德消毒后的啤酒；•③纯生啤酒：采用无菌酿造、特殊的过滤技术除菌、无菌灌装技术生产的•啤酒生产的工艺过程如下：3、葡萄酒•葡萄酒是葡萄发酵而成的一种饮料酒，酒度较低，一般介于8~22度。•分类：⑴以颜色分：①红葡萄酒——利用红色或紫色葡萄，果皮、果肉与果汁混在一起进行主发酵，发酵中含有果皮或果肉中的色素；•②白葡萄酒——用葡萄汁单独发酵制成黄色的葡萄酒，深金黄至淡灰黄不等。•⑵以含糖量分：①干葡萄酒——含糖量不超过1%；②半干葡萄酒——含糖量为1%~4%；③甜葡萄酒——含糖量至少为4%。有机酸发酵•有机酸发酵的应用：由微生物发酵法生产的有机酸有多种多接近自然产物，对人体有益。•应用于多种领域：⑴在食品和饮料中作为酸味剂，如汽水；⑵在水果罐头、果冻、果酱中具有保护色作用、抑制腐败微生物生长；⑶在医药工业上，柠檬酸是很好的抗凝血剂葡糖酸钙补钙；⑷在化学工业中，用于洗涤剂、电镀；⑸用于化妆品、香皂沐浴液，可预防氧化与除臭；⑹其他领域：卷烟中、纤维处理、乳酸钙等等。•柠檬酸发酵：柠檬酸（citricacid）在化工、医药、食品等方面用途广泛。1893年以前主要从柑橘、菠萝和柠檬中提取，之后才开始以微生物进行有机酸发酵而获取主要由青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡孢霉等发酵产生。原理是：己糖、淀粉等原料转变为柠檬酸，先经过EMP糖酵解途径，然后通过TCA形成柠檬酸。•乳酸发酵：是重要的一元酸因存在于牛奶而得名，从牛奶中分离得到乳酸菌，开始应用于工业不同微生物异型乳酸发酵产物不同。乙酸发酵（食醋发酵）：食醋发酵机制是淀粉质原料在细菌、霉菌产生的淀粉酶作用下水解为葡萄糖等单糖，然后经EMP途径发酵葡萄糖产生乙醇和二氧化碳。在酵母菌作用下产生乙醇，最后在醋酸细菌作用下产生乙酸。氨基酸发酵•现在已经可以通过发酵法产生赖氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苏氨酸等12种氨基酸•氨基酸广泛用于食品、药品等多个领域氨基酸发酵食品工业可用于甜味剂、酸味剂、鲜味剂氨基酸发酵医药工业可作为高营养液、可用于降血氨、正血浆氨基酸失衡、治疗脂肪肝、治疗消化管溃疡、调节胃酸碱度、改善出血后遗症的记忆障碍、治疗心律失常等谷氨酸发酵•目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌等。谷氨酸的生物合成包括糖酵解作用（EMP途径）、磷酸戊糖途径（HMP途径）、三羧酸循环（TCA循环）、乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路等。谷氨酸发酵•生物合成谷氨酸的主要方式是α-酮戊二酸的还原性氨基化作用。谷氨酸的生物合成受机体内复杂机制的调控。影响谷氨酸发酵过程的参数有很多，谷氨酸发酵过程主要受种子质量，培养基组成，温度，pH以及供氧速率等因素控制。提取谷氨酸常用的工艺为等电点法和离子交换法合成途径•谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨•酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。菌株特点：1.革兰式阳性2.不形成芽孢3.没有鞭毛，不能运动4.需要生物素作为生产因子，通气条件下才能产生谷氨酸用途谷氨酸除用于制造味精外，还可以用来治疗神经衰弱以及配制营养注射液等。我国的谷氨酸发酵虽然在产量、质量等方面有了较大的提高，但与国外先进水平相比还存在一定差距。主要表现在：设备陈旧，规模小，自控水平、转化率和提取率低，易受噬菌体污染，废水污染问题尚未完全解决等赖氨酸发酵•赖氨酸：•碱性氨基酸，有D型和L型构型•人体必需氨基酸之一•谷类食物中最缺乏的氨基酸作用：•提高智力、促进生长、增强体质。•增进食欲、改善营养不良状况。•增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。•改善失眠，提高记忆力。•帮助产生抗体、激素和酶，提高免疫力、增加血色素。•帮助钙的吸收，治疗防止骨质疏松症•降低血中甘油三酯的水平，预防心脑血管疾病的产生。•用于饲料工业可提高禽兽的增重，改善肉质•乏赖氨酸的症状包括疲劳，虚弱，恶心，呕吐，头晕，没有食欲，发育迟缓，贫血等生产菌株生产菌种•细菌：棒杆菌、短杆菌假单胞菌、埃希氏菌、芽孢杆菌•真菌：酵母、假丝酵母、隐球酵母•谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和乳糖、发酵短杆菌的各种突变菌发酵法•二步发酵法（前体添加法）：50年代初开发的二步发酵法以赖氨酸的前体二氨基庚二酸为原料，借助微生物生产的酶（二氨基庚二酸脱羧酶），使其脱羧后转变为赖氨酸发酵法•直接发酵法广泛采用的赖氨酸生产法。常用的原料为甘蔗或甜菜制糖后的废糖蜜、淀粉水解液等廉价糖质原料。此外，醋酸、乙醇等也是可供选用的原料。直接发酵法生产赖氨酸的主要微生物有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌的突变菌等3种。发酵法•酶法主要用生产尼龙原料己内酰胺时生成的大量副产物环己烯为起始原料，用化学方法合成DL-氨基己内酰胺，然后以此作为酶反应的底物，经罗伦氏隐球酵母生产的L-氨基己内酰胺水解酶，和从奥巴无色杆菌菌体中分离到的α-氨基己内酰胺外消旋酶共同作用，转变为L-赖氨酸。该工艺由于反应速度快，原料便宜，产酸率高，已投入工业生产酶制剂发酵•酶制剂（英文：enzyme)是一类从动物、植物、微生物中提取具有生物催化能力的蛋白质。具有高效性，专一性，在适宜条件（pH和温度）下具有活性。主要作用是催化食品加工过程中各种化学反应，改进食品加工方法。•应用范围：植物由于生长地域、季节、气候等的影响，生产酶制剂的产、质量都不稳定。动物产生的酶主要从屠宰牲畜的腺体中提取，来源有限；只有微生物生产的酶，可满足任何规模的需求，产率高、质量稳定。目前，除食品、轻纺工业外，微生物酶制剂还用于日用化学、化工、制药、饲料、造纸、建材、生物化学、临床分析等方面，成为发酵工业的重要部门。种类•国外：在饲料中使用的酶制剂主要有淀粉酶、β－葡聚糖酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、脂肪酶、植酸酶、角蛋白酶、木聚糖酶等。•国内：市场主要的酶制剂有淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、β－葡聚糖酶、植酸酶等。目前除植酸酶有单一产品外，其余饲用酶制剂大多是包含多种酶的复合制剂。•生产酶制剂的微生物有丝状真菌、酵母、细菌3大类群，主要是用好气菌淀粉酶•淀粉酶水解淀粉生成糊状麦芽低聚糖和麦芽糖。以芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌深层发酵生产为主，后者产生耐高温酶。另外也用曲霉属和根霉属的菌株深层和半固体发酵生产，适用于食品加工。-淀粉酶主要用于制糖、纺织品退浆、发酵原料处理和食品加工等。葡糖淀粉酶能将淀粉水解成葡萄糖，现在几乎全由黑曲霉深层发酵生产，用于制糖、酒精生产、发酵原料处理等。蛋白酶•使用菌种和生产品种最多。用地衣形芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌以深层发酵生产细菌蛋白酶；用链霉菌、曲霉深层发酵生产中性蛋白酶和曲霉酸性蛋白酶，用于皮革脱毛、毛皮软化、制药、食品工业；用毛霉属的一些菌进行半固体发酵生产凝乳酶，在制造干酪中取代原来从牛犊胃提取的凝乳酶。微生物多糖•微生物在代谢过程中可利用单糖和双糖产生多糖对微生物具保护作用的生物高聚物。近二十年来，由于糖化学的迅速发展，微生物胞外多糖的研究逐渐引起人们的广泛关注于重视。自二十世纪五十年代以来，采用发酵工程技术生产多种微生物多糖是国际上的热门课题，并已有数种微生物多糖已具备相当的工业化规模。•按合称位点和合成模式的不同可分为两种类型：同型多糖的合成与异型多糖的合成。•黄原胶：肠膜状明串珠菌和葡聚糖明串珠菌用于工业制造葡聚糖（是若干葡萄糖脱水形成的聚合物）。Glucan是世界上早发现并较早作为主要的血浆代用品的微生物多糖。右旋糖酐-70是目前公认的优良血浆代用品之一。临床主要用于治疗由于失血、创伤、烧伤和中毒等引起的失血性休克。•葡聚糖：又称右旋糖酐。为一种多糖。存在于某些微生物在生长过程中分泌的粘液中。葡聚糖具有较高的分子量，主要