植物基因克隆实验总结

2015-2016第二学期生物科学实验（植物基因克隆）实验总结班级：13级生物科学2班学号：1312022005姓名：邓伟强日期：2016年6月10日一、实验原理及方法：实验原理：基因的克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展，使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。实验方法及过程：1.CTAB法提取水稻基因组DNA配制CTAB溶液：(2gCTAB,3.17gNacl,1mol/LTrisHcl10ml(PH8.0),EDTA4ml,最后定容至100ml.)配制TBE溶液：（24gTrisHcl,1.488gNa2EDTA.2H2O,11g硼酸，最后定容至200ml.）2.配置琼脂糖缓冲液：10×TBEBuffer配制方法：每组需要：称量下列试剂，置于1L烧杯中Tris：108gNa2EDTA·2H2O：7.44g硼酸：55g向烧杯中加入约800ml的无菌水，充分搅拌溶解。加无菌水将溶液定容至1L后，室温保存。用时稀释。3.开发设计引物LOC_Os02g42310Chromosome2:25,442,875-25,450,093OsSCP8-PutativeSerineCarboxypeptidasehomologue,expressedOryzasativaJaponicaGCATATGTCAACATCTCATCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAATCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACATACATATGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryzasativaIndicaGCATATGTCAACATCTCATCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAATCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACATACATATGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryzasativaJaponicaGCGCCGGAGACGAAGAGTTGGAAAATTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTATAATTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTATOryzasativaIndicaGCGCCGGAGACGAAGA-----------------ATTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTATAATTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTATOLIGOstartlentmgc%any3'seqLEFTPRIMER92259.6045.454.000.00AACATCTCATCTCCGTGTTTCRIGHTPRIMER1682059.7750.005.003.00ACTCTGGACCGTGCAAACTTLength：201japonica,193Indica4.PCR反应体系10×扩增缓冲液：每管：2ul共需：24uldNTP混合物：每管：0.8ul共需：9.6ul模板DNA：每管3ul，共需36ulTaqDNA聚合酶：每管0.3ul，共需3.6ul引物1、2：每管：2ul（前引物1ul、后引物1ul）共需24ul。两种引物各6管。引物1、2代表的体系分别加灭菌水71.4ul至120ul，分装6个ep管。5.PCR反应程序95℃预加热5分钟，95℃30秒钟56℃30秒钟35循环72℃30秒钟72℃10分钟16℃5分钟总时长：1小时35分钟6.琼脂糖凝胶电泳制胶：称取1.6g琼脂糖于配好的160mlCTAB溶液（稀释10倍后的）中，在微波炉中加热溶解，冷却后，加入3ul的核酸染色剂（BE）。倒胶：插入梳子，摇匀之后倒胶（1LTBE缓冲液，淹没琼脂），避光静置大概20min。点胶：垂直拔掉梳子，把凝好的胶取出来放在有与制胶同浓度TBE缓冲液的电泳槽中。在第一个胶孔中加入maker，作对比。上样：取2ulLoadingBffuer（一种沉淀剂，使点胶后样品沉到胶孔底部不浮上来）混匀10ul的DNA样品。用移液枪打入胶孔。电泳：电压电流(100V、100mA)跑40min。7．紫外灯下观察条带条带清晰一段说明含DNA多。8.切胶回收（1）切胶，然后加入胶的三倍体积的BufferGA（若小于300bp，按1：5）本组切下的三份胶均为0.15g，分别加入了450ul的BufferGA（2）55度水浴10分钟，期间摇晃2~3次（3）加入200ulBufferBL于离心柱，12000rpm离心30秒，弃上清（4）将第2步得到的溶液中加到离心柱中，静置2分钟，12000rpm离心30秒，弃上清（5）往离心柱加入500ul的rashBuffer，静置2分钟，12000rpm离心30秒，弃上清。（6）重复（5）（7）12000rpm离心1分钟（空管离心去乙醇）（8）将离心柱转移到一干净的1.5毫升离心管中，保持离心管开放状态5~10分钟（挥发乙醇）（9）加20~60ul的Elution(洗脱液)，65度预热，静置2分钟(10)12000rpm离心2分钟，保存在-20度冰箱9.LB培养基（用于培养大肠杆菌）：酵母提取物5g/L胰蛋白胨10g/LNaCl10g/L琼脂15g（固体）Amp：100ug/ml10.T-载体连接：（1）将回收PCR产物与T-载体连接PMD18-TVector0.5ulSolutionI2.5ulPCR回收产物2ul总5ul（2）离心至底部（3）PCR仪中16度反应90分钟。（或者4度过夜连接）11.大肠杆菌感受态的热激转化：取出感受态细胞于冰上化冻后，加入T载体连接产物，轻轻摇匀后在冰上放置30min。移至42℃水浴中热激90sec，再迅速放回冰上冷却5min。加入600μl不含抗生素的LB液体培养基于37℃振荡培养1h。活化后的菌液涂布于含相应抗生素的筛选平板上，37℃培养过夜。提取单克隆：在筛选平板上选取单个稍大的白色菌落。在超净工作台上，吸取500ul液体加Amp的LB培养基于EP管中，用最小的枪头挑取平板上的选取一个白色菌落，伸入LB液体中抽吸混匀，摇菌培养5h。12.检测：利用PCR引物进行菌液PCR检查，再次进行电泳，紫外灯观察条带（观察结果见实验结果），阳性克隆送测序公司测序。二、实验结果与分析：实验结果：实验成功，如图：实验结果分析：本组实验的DNA使用的是上一组提取保存备用的。最后得到的实验结果如图，在紫外灯下观察到了清晰的条带说明实验达到了预期的效果，实验成功。实验最后由于上一大组的已经测过序了，所以我们大组并没有拿去生物公司测序。三、讨论：由于本次实验是分为两组，按照加引物1为一组，引物2为一组，每组反应体系为6ep管。实验过程由全部人员一起操作完成，在配置试剂，配反应体系等时，小组成员进行了分工合作，由于每步上并不能保证绝对无误，所以在实验过程中有很多需要注意的地方，并进行如下讨论：1、本大组直接从第三步进行了实验，没有进行第一步提取DNA，本组直接使用的上一组保存备用DNA的。2、第四步中，加反应体系时，由于两个人进行操作，一人负责引物1、一人负责引物2，在使用移液枪时由于使用不规范（比如量度没有调节准确，枪头没有固定好等），可能会导致误差，以致在紫外灯下观察时得到的不是清晰的条带，，扩增得到的DNA不多，就会影响后续过程比如T-载体的连接。因为反应体系中所加的量很少，以微升来计，所以操作时要特别注意。3、第六步中，在进行琼脂糖凝胶电泳时，插入梳子是在靠近负极（黑头），上样时要注意，在将样品加入到胶孔中时，可以先在一次性手套上混匀，用移液枪将样品打入时，要看清胶孔，不能让样品溢出，也不能插得太深而把胶孔弄破。4、第七步中，将跑完电泳的琼脂糖凝胶在紫外光灯下观察，观察到只有前六个孔跑出的条带清晰，后六孔条带没有明显清晰的一条，所以切胶时只切了前六孔跑出的一条条带，因为清晰条带扩增的DNA多。后六条孔没有跑出一条清晰的条带这可能跟反应体系时加料不准确以及点样时操作不当有关。总之，实验过程是环环相扣的，上一步的操作失误会影响下一步的操作，所以我们应该要求自己每一步都要细致认真。5、第九步中，配培养基需要配固液两种，试剂和材料见第九步，液体培养基不加琼脂。6、第十一步中，有的操作比如热击90秒，需要精确计时，这就要求小组成员之间一人操作，一人计时。而有些操作需要在超净工作台上完成（消毒工作要做好），在操作前要先将超净工作台开紫外灯灭菌（至少10分钟），紫外灯有辐射，不能靠太近。活化后的菌液于超净工作台涂布时要靠近酒精灯操作，如果操作不当染菌了，会对后续的实验造成影响。得不到白色大肠杆菌菌落，就不能提取单克隆。四、个人实验体会：(与别人类似的实验比较，你的实验方法与结果的优点与缺点)实验操作一定要细心谨慎，比如在进行电泳的时候，稍不留神可能会溢出或插的太深。因前期实验失败，只能用上一组保存备用的DNA，实验操作问题还需要自身改进。使用PCR扩增方法较为便捷，灵敏度高，简洁迅速，对样本纯度要求低，很适合学生进行实验室操作。进行这个实验的时候，正好是挑战杯校赛的关键阶段，很多实验操作都是组内同学完成了，自己参与度较低，在这个他们看不到的地方跟他们说一声谢谢。也十分感谢老师的悉心指导。我自己是个实验弱，在做实验方面差很多，多亏了老师和同学们一直以以来的帮助和指导。