单分子技术

单分子技术导言1986年诺贝尔奖颁发给了扫描隧道显微镜，是非示意图的真实分子图像。但是原子内部内部的情况还看不到，只有靠推理，能够看到离子键这一等级。今年20nm~50nm的超分辨力荧光物的发现引起很大轰动。荧光标记放大使超分辨率荧光显微镜能超越衍射极限。单分子科学及其发展1、传统机械测试和近代微纳测试的发展光学显微镜→电子显微镜→扫描隧道显微镜→超分辨荧光2、生命单元的基本功能主要取决于单个大分子，单分子操纵方法在研究单个生物分子的性质上有着独特的优势。与测量分子集合体整体性质的传统方法相比，单分子技术具有直接，准确，实时等优点。单分子操作技术主要应用一定的实验仪器和方法，对单个分子进行操作，它包括原子力显微镜技术、光镊技术、单分子荧光光谱技术等。扫描隧道显微镜及其应用介绍扫描隧道显微镜亦称为“扫描穿隧式显微镜”、“隧道扫描显微镜”，是一种利用量子理论中的隧道效应探测物质表面结构的仪器。它作为一种扫描探针显微术工具，扫描隧道显微镜可以让科学家观察和定位单个原子，它具有比它的同类原子力显微镜更加高的分辨率。此外，扫描隧道显微镜在低温下（4K）可以利用探针尖端精确操纵原子，因此它在纳米科技既是重要的测量工具又是加工工具。STM使人类第一次能够实时地观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物化性质，在表面科学、材料科学、生命科学等领域的研究中有着重大的意义和广泛的应用前景，被国际科学界公认为20世纪80年代世界十大科技成就之一。工作原理扫描隧道显微镜的工作原理简单得出乎意料。就如同一根唱针扫过一张唱片，一根探针慢慢地通过要被分析的材料（针尖极为尖锐，仅仅由一个原子组成）。一个小小的电荷被放置在探针上，一股电流从探针流出，通过整个材料，到底层表面。当探针通过单个的原子，流过探针的电流量便有所不同，这些变化被记录下来。电流在流过一个原子的时候有涨有落，如此便极其细致地探出它的轮廓。在许多的流通后，通过绘出电流量的波动，人们可以得到组成一个网格结构的单个原子的美丽图片。具体应用•扫描STM工作时，探针将充分接近样品产生一高度空间限制的电子束，因此在成像工作时，STM具有极高的空间分辨率，可以进行科学观测。•探伤及修补STM在对表面进行加工处理的过程中可实时对表面形貌进行成像，用来发现表面各种结构上的缺陷和损伤，并用表面淀积和刻蚀等方法建立或切断连线，以消除缺陷，达到修补的目的，然后还可用STM进行成像以检查修补结果的好坏。•微观操作引发化学反应STM在场发射模式时，针尖与样品仍相当接近，此时用不很高的外加电压（最低可到10V左右）就可产生足够高的电场，电子在其作用下将穿越针尖的势垒向空间发射。这些电子具有一定的束流和能量，由于它们在空间运动的距离极小，至样品处来不及发散，故束径很小，一般为毫微米量级，所以可能在毫微米尺度上引起化学键断裂，发生化学反应。移动，刻写样品当STM在恒流状态下工作时，突然缩短针尖与样品的间距或在针尖与样品的偏置电压上加一脉冲，针尖下样品表面微区中将会出现毫微米级的坑、丘等结构上的变化。针尖进行刻写操作后一般并未损坏，仍可用它对表面原子进行成像，以实时检验刻写结果的好坏。原子力显微镜在单分子研究中的应用背景多年以来，人们对微观世界的观测和研究都是建立在系综平均的基础上，系综平均就是一种平均的思想，即系综个体物理量轨迹的时间平均等于该物理量在给定时间的系综平均，这种思想对于一个包含完全相同个体的系综虽然测量结果有其合理性，但是这种均匀系统下的分子并非出于静态，而是不断运动，平均效应的结果就是掩盖了许多特殊的信息。那么单分子技术便体现出它的必要性，它对体系中单个分子的行为进行研究，可以得到在特定时刻，特定分子的特殊位置和行为，因为在某一时刻，集团中的任何成员只能处于一种状态。将此再与时间相关，还可得到单个分子的行为的分布状况。这样我们就可以同时得到所研究的对象的整体行为和个体行为了，然后将数据综合处理，得到更为全面的信息。AFM技术的支持目前用于单分子研究的技术很多，包括观察其构象的变化、功能活动，以及与其它分子相互作用的动力学过程，都可揭示出过去检测多分子集体行为平均化所掩盖的“个性”和蕴藏的丰富信息，从而深入了解生命活动的微观规律。可将其归纳成以下两个方面：扫描探针技术和光学和光谱技术。本文就扫描探针技术中原子力显微镜AFM在单分子技术中的应用做简单的解释和说明。AFM原理有一个形象一点比喻是，类似于盲人拿棍子去探索表面路况一样，通过棍子不停在地面各个位置地敲击，再加上人对于棍子敲击反馈的力进行感受，盲人便能够知道地面的大概形貌。原子力显微镜的整个系统就好比是盲人系统，弹性微悬臂好比是人的手，它的探针粘在微悬臂上，便是盲人的盲棍，探针以一定的频率在样品表面进行操作，探针与被测样品之间有微弱的相互作用力（原子力），原子间的排斥力会使得微悬臂轻微变形，而这个可以作为探针和样品间排斥力的直接量度。一束激光经微悬臂的背面反射到光电检测器，可以精确测量微悬臂的微小变形，这样就实现了通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。原子力显微镜分辨率可达到原子级水平，其横向分辨率可达2nm，纵向分辨率可达0.01nm，下图所示为AFM结构示意图。图一AFM结构示意图图二AFM在蛋白质复合体力测量中的典型力曲线采用力扫描模式，原子力显微镜可以在单分子水平测定两个相对独立表面间的相互作用，出现就是典型的原子力显微镜力曲线。当微悬臂上抬时，通过测量相对于“零点力”的偏移量，得到悬臂接触表面后返回的曲线，从而得到力(图2)。在很多实验中，微悬臂的移动速度达到每秒几个微米时，力的曲线通过测定微悬臂速度就可得到。由于介质中存在阻力，微悬臂在自由接近和向后拉时将经受一个与速率成比例的弯曲常数。通过对其原理的探究可以看出其有两方面的主要用途，一是可以作为三维成像工具来显示被测物表面的信息；二是它的微悬臂以及探针可以作为施力装置来对被测物进行一定的操纵。原子力显微技术的迅速发展它在生命科学领域的应用日趋广泛下面分别就上述两个方面展开阐述：AFM应用1、成像作为成像工具，AFM主要有以下特点，精度高，它可以实现三维相貌的测量，得到物体表面欺负的信息，而且因起利用的是原子力，可以对绝缘物质进行测量，在生物单分子技术中，它的成像作用表现在以下两个方面：1）AFM能在真空气体液体等多种环境中使用，可以在生理条件下以分子亚分子分辨率得到生物分子及样品表面的三位图象，可以进行生物大分子的超微结构观察。2）能对生物大分子的生理生化过程进行实时动态观察。2、施力目前，AFM与光学镊子技术和磁性珠技术都可以作为单分子操纵技术，但是他们有着不同的力学灵敏度以及动力学响应区间，AFM的力学谱范围为大于1pN，响应时间不小于1us，作为施力工具的使用情况，在生物领域的应用可以有以下几个方面，本部分简单的用自己的话介绍现今AFM的几个应用：1）研究生物膜表面的配体-受体相互作用2）将外源物质投递到细胞中3）研究细胞的机械性AFM压细胞的力学曲线AFM的局限虽然AFM可以成功地测量各种细胞的机械性能,但是,很多因素限制了AFM的发展,即AFM技术中存在许多需要克服的问题:(1)AFM一次性只能测量一个细胞的机械性能,而这个细胞能否成为众多细胞的代表,仍不可控制；(2)但是AFM成像时会对大分子施加力，因而可能会使样品由于受压或牵拉而产生变形；(3)热力学扰动仍会干扰实验结果；(4)测试效率低。