搜索
第三代PCR技术---数字PCR简介发展历程：1999年----Vogelstein等在检测粪便中进行癌变组织脱离细胞的BRAF特异突变型基因时，提出了数字PCR的概念；2006年----美国Fluidigm公司开发出第一台商业化的数字PCR系统，它是基于集成流体通路（IFC）芯片。2010年---LifeTechnologies也推出了数字PCR产品线–OpenArray系统。2011年---QuantaLife公司开发出微滴数字PCR（ddPCR）技术，并因此获得2011年度Frost&Sullivan北美新产品创新奖。2011年10月，Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术，推出了QX100微滴式数字PCR系统。2012年---RainDance公司的RainDropTMdPCR系统价格从高到底：Raindance、Bio-Rad、LIFETechnologies技术优势：与实时荧光定量PCR不同的是，整个数字PCR过程不需要扩增标准曲线和标准品，具有良好的准确度和重现性，可以实现真正意义上的绝对定量；数字PCR的灵敏度，除了与检测器的灵敏度和PCR扩增效率等因素有关外,很大程度上取决于反应单元的数目。反应单元的数目越多,数字PCR的灵敏度越高,准确度也越高。产品分类：基于分液方式的不同，数字PCR主要分为3种：微流体数字PCR(MicrofluidicdigitalPCR，mdPCR)、微滴数字PCR(DropletdigitalPCR，ddPCR)和芯片数字PCR(ChipdigitalPCR，cdPCR)。数字PCR技术原理：数字PCR一般包括两部分内容,即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段,数字PCR先将样品稀释到单分子水平,再平均分配到几十至几万个单元中进行反应。与qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法不同,数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集,有荧光信号记为1,无荧光信号记为0,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的。理论上,在样品中目标DNA浓度极低的情况下,有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是,通常每反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子,就需要使用泊松概率分布函数(Poissondistribution)进行计算,根据反应单元总数、有荧光信号的单元数以及样品的稀释系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。1、mdPCR：mdPCR于微流控技术，对DNA模板迚行分液，微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再与PCR反应体系结合，mdPCR已逐渐被其他方式取代；2、cdPCR（芯片）：cdPCR利用微流控芯片技术将样品的制备、反应、分离和检测等集成到一块芯片上，目前的仪器主要有Fluidigm公司的Bio-Mark™基因分析系统和LifeTechnologies公司的QuantStudio系统。利用集成流体通路技术在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增，实现绝对定量。特点：反应液通过微流控等技术被均匀导入芯片上的反应仓或通孔中进行PCR反应，然后通过类似于基因芯片的方法扫描每个反应仓或者通孔的荧光信号，进而计算目的序列的含量。目前，每张芯片上集成有相互独立的１万～４万个（Bio-Mark™HD）反应仓或者２万个（QuantStudio3D）通孔。成本低、体积小和高通量,是理想的数字PCR平台；3、ddPCR（微滴）：ddPCR技术，是相对成熟的数字PCR平台，利用油包水微滴生成技术，目前的仪器主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系统和RainDance公司的RainDropTMdPCR系统，其中Bio-rad公司的dPCR系统利用油包水生成技术将含有核酸分子的反应体系生成20000个纳升级微滴，经PCR扩增后，微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测；特点：利用微滴发生器可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴,作为数字PCR的样品分散载体。把每个样本反应液均匀分割成2万个（QX200）或100个～1000万个（RainDrop）乳液包裹的微液滴，在每个微滴内分别进行PCR扩增反应。PCR反应结束后检测每个微滴的荧光信号。通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的PCR反应体系,更容易实现小体积和高通量,而且系统简单,成本低,因此成为理想的数字PCR技术平台。优点：灵敏度高、单分子检测；准确性强，数字化分析；适合临床，全封闭；应用：无创产筛、肿瘤液态活检、血筛；