吖啶橙染色法

吖啶橙染色法检测细胞凋亡实验试剂、仪器：吖啶橙，稀释液PBS（磷酸缓冲液pH7.0～7.2），1％吖啶橙贮存液，细胞爬片，载玻片，盖玻片，荧光显微镜。吖啶橙：3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3·HCl·ZnCl2,分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。实验步骤：1.配置吖啶橙贮存液（1%）：300mg吖啶橙溶解于30mlPBS缓冲液中，滤过，4度避光保存。2.染色时，稀释100倍至终浓度为0.01%。取300微升的PBS缓冲液，加3微升的吖啶橙贮存液混匀，室温避光染色5min。3.在荧光显微镜下选520nm的激发光观察。实验结果：正常细胞核的DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红荧光。出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光，甚至见黄绿色碎片。细胞坏死时，细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均减弱或消失。