主要禽病的实验室检测方法及结果分析

主要禽病的实验室检测方法及结果分析张国中（中国农业大学）2011年4月23日2（一）血清学检测方法1、免疫血清学技术抗原与抗体在体内（外）均可发生特异性结合反应，因为抗体主要来自于血清，在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。一、常用的实验室检测方法3血清学反应的一般特点高度特异性反应可逆性反应二阶段性影响反应的因素4血清学反应的应用抗原抗体的快速检测微生物的鉴定与分析生物活性物质的超微定量抗原抗体在细胞和亚细胞水平定位52、血清学反应类型及常用试验方法反应类型常用试验名称凝集试验直接凝集试验→平板凝集试验（SPA）血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）沉淀试验琼脂免疫扩散试验（AGP）中和试验病毒中和试验（VN）标记抗体技术酶标记技术→酶联免疫吸附试验（ELISA）6（1）平板凝集试验（SPA）基本原理：细菌、红细胞等颗粒状抗原与相应抗血清在电解质存在情况下，产生可见的颗粒凝集现象。主要应用：鸡白痢（SP）支原体（MG/MS）图1平板凝集试验检测结果8（2）血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）基本原理：某些病毒（如NDV）能够凝集特定种类动物的红细胞，此即红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可以被特异性抗血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。主要应用：新城疫（ND）禽流感（AI）产蛋下降综合症（EDS）鸡传染性支气管炎（IB）图2血凝抑制试验检测结果G.Cattoli（OIE）10（3）琼脂免疫扩散试验（AGP）基本原理：可溶性抗原（毒素、病毒、细菌裂解液）与相应抗体结合,在电解质存在情况下，产生可见的沉淀物。主要应用：鸡马立克氏病病毒（MDV）鸡痘病毒（FPV）图3琼脂扩散试验检测结果1.抗原；2.阳性对照；3-6.待检血清；7.阴性对照12（4）病毒中和试验（VN）基本原理：抗原与相应的抗血清按适当比例混合作用后，可被中和而失去感染实验动物、组织细胞或鸡胚的能力。主要应用：鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的血清分型。图4采用鸡胚接种进行IBV分离空白对照病毒接种图5采用中和试验对疑似IBV分离物进行鉴定与分型空白对照病毒接种病毒+抗血清15（5）酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理：抗原抗体反应的特异性酶促反应的高效性使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性；使抗原（或抗体）与某种酶连接成酶标物，这种酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留酶的活性。16主要应用：多种禽病检测抗体检测最常用ELISA方法：间接法，是利用酶标记的抗抗体（一般为抗鸡IgG）检测已与固相抗原结合的抗体。图6间接ELISA方法测抗体的基本原理示意图固相载体包被抗原待检抗体酶标二抗底物显色18考虑血清学检测的目的血清样品的采集方法采集血清样品的数量血清样品的标记血清样品的贮藏及运输3、血清学检测应注意的问题191、病原分离鉴定（1）定义：指通过人工培养的方法分离出病原体的过程。（二）病原学检测方法20（2）病原分离主要目的进行疾病诊断疾病确诊的黄金方法病原学研究的基础21（3）病原分离方法细菌分离培养：各种培养基病毒分离鉴定：鸡胚、细胞或实验动物接种22（4）进行病毒分离应注意的问题样品采集时间采集样品种类样品贮藏及运输常见接种途径常用鉴定方法232、聚合酶链式反应（PCR）（1）主要目的：通过对特异性基因片段的检测达到检测病原体的目的。（2）优缺点：方便快捷、存在假阳（阴）性图7常规RT-PCR检测结果（电泳图）253、其它病原学检测方法（1）血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验（2）琼脂免疫扩散试验（AGP）（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）（4）胶体金试纸条检测（5）动物实验检查261、雏鸡母源抗体检查（1-3日龄）（1）了解原产地的免疫种类了解原产地易发病种类及保护性水平确定需根据当地情况加免的疫苗根据抗体反应追踪是否有过感染二、实验室监测方案的制定27（2）了解母源抗体水平根据母源抗体水平及各种疫病母源抗体半衰期合理确定疫苗首免时间了解雏鸡免疫保护能力，便于疫病诊断282、免疫检查（1）免疫前检查目的是了解免前抗体水平、决定免疫时间和进行免疫效果评价。初免前检查再免前检查29（2）免疫后检查目的是检查免疫效果，评价免疫成功或失败，尽快采取相应措施确保生产安全。通常应选择免疫后14-21天进行。30（3）定期检查目的是规律性检查抗体消长水平以便及时采取补救措施，分析各种免疫之间的相关性，调整免疫程序。31（4）重要节点检查30~50d检查（检查前几次免疫效果）开产前检查（产蛋期及雏鸡保护性抗体需求）36~40W检查（确定抗体水平、适时补免）323、生产发生变动时的检查（1）日常规律性抗体监测做为发病时检查的参考数据做为鸡群抵抗力的依据，指示病因分析方向做为流行病学分析数据，利于发现病原变异33（2）双份血清检测鉴于发病后抗体常有明显升高，双份血清抗体值对比分析有很好的诊断价值。34（3）抗原检测某些情况下，抗原检测可以直接证实感染状况的存在。35（4）未免疫鸡群抗体检测未免疫鸡群某疾病抗体的出现，特别注意雏鸡母源抗体消失后抗体的再出现以及随日龄增加而抗体持续上升的现象，这对疾病诊断十分重要。364、重要疫病流行动态分析流行动态分析对生产企业来说，开展具有一定的难度，但对重要疫病，尤其是重点进行免疫防控的疫病仍然值得重视，对长期的流行资料进行分析，会得到极为有益的技术支持。37流行动态分析需要进行大量工作，除抗体监测外，必需配合针对性的实验室研究工作，如病原分离鉴定、动物实验和必要的分子生物学研究。381、HI检测结果与分析（1）常见HI检测结果1-3d15-25d25-35d35-50d50d开产前36w左右≥40wH5N125-720-320-423-526-727-925-627-9H9N225-920-323-524-727-829-1226-729-11ND25-920-323-525-827-1029-1227-829-12三、重要疫病的常见检查结果与分析图8种鸡开产前NDV抗体检测情况40（2）免疫抗体空档期15-25d是母源抗体逐渐消失，新的免疫抗体尚未建立的时期野毒侵袭大多发生于此，一般18-25d多发空档期随免疫（程序和疫苗）成功达到最短图9NDV母源抗体衰减情况图1015-30日龄雏鸡NDV抗体检测情况43（3）HI检查的抗体离散度在4lg2内是允许范围大于4lg2的基本原因初免时母源抗体水平参差不齐免疫成功率不高-漏免太多疫苗质量不好二免后离散度应达到要求44（4）抗体保护临界值通过攻毒试验加以验证的结果AIV要求≥26NDV要求≥28-10临界值是针对有效保护对等而言，即疫苗和流行毒株有良好的相关性。当流行毒株变异而疫苗株保护性不足时，原有临界值在一定程度上失去意义，需要新确立或提高临界值水平。45（5）诊断试剂问题抗原问题：抗原不纯（影响HA的确定）抗原制备毒株和流行毒株存在明显差异阳性血清问题：阳性血清不纯46（6）诊断指标H5N1双份血清检测：应用常规Re-4、Re-5苗免疫情况下，如果知道发病前抗体水平，则发病后10-14d可检测出Re-4、Re-5抗体滴度上升22-3。未免相应疫苗的情况下，检测变异株抗体达到26-9有诊断价值。图11某肉种鸡群发生H5感染前后抗体检测结果（38W发生，2W产蛋率75%→5%，死淘20%）图12某肉种鸡群H5感染后变异株抗体检测结果（换羽24W发生，降蛋10%，累计死亡率5%）49H9N2产蛋鸡发病后10-14天，HI抗体20%以上达到212以上有诊断价值。雏鸡20-30dHI抗体达到26-9有诊断价值。50ND产蛋鸡发病后10-14d，HI抗体≥213有诊断价值。雏鸡20-35dHI抗体达到26-9有诊断价值。图13某肉种鸡群发生NDV感染后抗体检测结果52HI诊断应注意的问题HI诊断应结合临床表现，当临床表现无异常而检测结果异常时往往是检测结果出了错，应提高警惕。532、平板凝集试验（SPA）检测结果与分析（1）可用于MG、MS、SP检查（2）可进行血清平板和全血平板，相对来说血清平板更准确和易于判断。54（3）SPA准确率相对较差，假阳性率高，一般群体检查超过30%以上阳性才有确实群体感染的诊断意义。（4）国内产品和国外产品特异性上有一定差距。553、琼脂扩散试验（AGP）检测结果与分析（1）可用于MD、POX和IC（2）对MD可进行抗体、抗原两种检测50d左右，50%以上抗体阳性预示疫苗反应正常用羽髓做琼扩有发病诊断价值56（3）POX常不用检测，通过观察接种部位反应可了解免疫效果，观察临床症状进行疫病诊断。（4）IC的琼扩试剂很少，可从国外进口或选用日本北里所的间接血凝试剂。574、ELISA检测结果与分析（1）目前可应用ELISA检测的疾病ND、AIMG、MS、SPIB、IBD、REO、AE、RE、ILT、CIAALV-A/B、ALV-J、ALV-Ag58（2）常见ELISA检测结果1-3d15-25d25-35d50d开产前产蛋期IB2000-80000-10001000-20002000-80002000-150002000-15000IBD2000-80000-15002000-40004000-100004000-100004000-12000REO2000-50000-5000-20002000-60002000-150002000-15000ILT2000-30000-10000-5002000-40002000-60002000-6000AE500-20000-5000-300300-6000300-8000500-8000CIA+（0.3）+/--+/-+（0.1）+（0.1）59（3）ELISA试剂盒之间的差异每种试剂盒都有自己的特定的阳性值及敏感范围。原则上同一疾病不同厂家ELISA试剂盒之间没有直接可比性，除非做过平行对比研究。同一病原的抗体检测可能针对的抗原表位不同会得到不同结果，要格外慎重。60（4）对REV检测结果的认识REV抗体检测结果应该为阴性。20-30d检出阳性率超过20％则预示鸡群可能存在严重免疫抑制问题。61当1-15d检出100％阳性率时，可能大鸡免疫或污染过；检出少于5％阳性率时，可能种鸡是污染群或假阳性结果。超过30d以上的检测通常都只能做为污染的佐证，但至少20%以上才有生产影响意义。图14某鸡场免疫禽痘疫苗后的REV抗体检测结果（2W免疫，8W和11W检测）图15某鸡痘重组疫苗污染REV的检测情况图16污染鸡痘疫苗分离REV的遗传进化关系65（5）ALV检测利用种蛋进行ALV抗原检测准确度较好。肛拭子抗原检测假阳性较高，高阳性率有一定意义。抗体检测在不同日龄意义不同，雏鸡5%以下，开产前10%以下可能不会形成生产问题。目前ELISA试剂盒均不能区分内外源病毒。66（6）有诊断价值的数据IB、Reo的ELISA抗体15000预示存在野毒感染。应达到的指标在相应日龄检测达不到，指示免疫失败，应追踪疫苗质量和免疫技术。长期检测有助于了解抗体变化规律，用于指导疫苗选择和免疫程序的制定。按照常规做检测，有利于发病诊断和监督生产问题的发现。图1725W肉种鸡群IBV的ELISA抗体检测结果图18抗体异常血清鸡胚中和试验检测结果空白对照A2毒+A2血清A2毒对照A2毒+待检血清图19某1日龄雏鸡群MS抗体检测情况图20某50日龄鸡群MS抗体检测情况图21某35W肉种鸡群MS抗体检测情况图22某21W肉种鸡群APV抗体检测结果图23不同日龄鸡群CAV抗体阳性率情况74谢谢!