MTS测定细胞增殖方法

普洛麦格(北京)生物技术有限公司普洛麦格(北京)生物技术有限公司地址:北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909电话:[phone]传真:[phone]网址:普洛麦格(北京)生物技术有限公司®AQueousOneSolutionCellProliferationAssayI.描述………………………………………………………………………………………….………………….1II.产品组分和保存条件………………………………………………………………….………………………4III.操作步骤………………………………………………………………………………………………………5A.一般操作步骤………………………………………………………………………………………………….5B.应用举例：用B9细胞检测IL-6生物活性的操作程序……………………………………………………….5IV.通常需考虑的因素……………………………………………………………………………………………6A.背景吸光度值………………………………………………………………………………………………….6B.读取数据的可选波长………………………………………………………………………………………….6C.淋巴细胞检测………………………………………………………………………………………………….7D.试剂优化……………………………………………………………………………………………………….7E.细胞数的优化………………………………………………………………………………………………….7V.相关产品……………………………………………………………………………………………………….8VI.参考文献…………………………………………………………………………………………………….11I.描述CellTiter96®AQueousOneSolutionCellProliferationAssay(a)是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的检测试剂。此试剂含有一个新型的四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,innersalt;MTS(a)]和一种电子偶联剂(phenazineethosulfate;PES)。PES具有增强的化学稳定性，这使它可与MTS混合形成稳定的溶液。这种方便的“单溶液”模式，是在第一代CellTiter96®AQueousAssay的基础上的改进，CellTiter96®AQueousAssay中使用的电子偶联剂PMS与MTS溶液是分开提供的。MTS(Owen’sreagent)被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，可直接溶解于培养基中(图1,1)。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的NADPH或NADH的作用下完成的(2)。检测时，只需将少量的CellTiter96®AQueousOneSolutionReagent直接加入培养板孔的培养基中，孵育1–4小时，此中文说明书可以从以下网址请登陆以上网页查看您是否使用的是昀新版的说明书。如果您在使用这个系统时有任何问题，请与Promega技术支持联系。邮件:[e-mail]普洛麦格(北京)生物技术有限公司的吸光度值(3,4)。图1.MTS四唑盐和其甲臜产物的结构。在490nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比(图2)。由于MTS的甲臜产物在组织培养基中可溶，CellTiter96®AQueousOneSolutionAssay与MTT或INT法相比操作步骤更少(5,6)。MTT还原反应的甲臜产物是一种结晶沉淀，在检测（570nm）前需要额外的步骤来溶解这种结晶(7)。如果您目前在使用[3H]胸腺嘧啶掺入法，那么可以在通常需加入放射性胸腺嘧啶的时间点用CellTiter96®AQueousOneSolutionReagent来替代[3H]胸腺嘧啶。通过检测数据已证明基于MTS法的CellTiter96®AQueousAssay和基于MTT法的CellTiter96®Assay能够替代[3H]胸腺嘧啶法(4,7)。CellTiter96®AQueousOneSolutionAssay的优点:•使用简单:把试剂加入到细胞中,孵育，检测。•方便:过滤灭菌的单一溶液,即用型试剂。•快速:可直接在96孔板中进行检测，无需洗涤或富集细胞。也去掉了MTT检测过程中必须的溶解步骤。•无放射性:无需液闪溶液或放射性废物的处理。•灵活:检测板被检测后可重新进行孵育，以进一步显色。•安全:无需挥发性有机溶剂来溶解甲臜产物(与MTT不同)。1普洛麦格(北京)生物技术有限公司®AQueousOneSolutionAssay在490nm处检测细胞数对吸光值的影响。在加有RPMI的96孔板中加入不同数量的B9杂瘤细胞，RPMI中含有50uM的2-巯基乙醇，5%FBS和2ng/mlIL-6。培养基平衡1小时后,加入20µl/孔CellTiter96®AQueousOneSolutionReagent。在37°C，5%CO2浓度的细胞培养箱中孵育1小时,然后使用酶标仪检测490nm的吸光度值。每个数据点表示4个重复孔的均值±标准差，相关系数为0.993,说明细胞数和吸光度值呈很好的线性相关性。背景吸光度值（对应0细胞/孔）没有从数据中减去。2普洛麦格(北京)生物技术有限公司®AQueousOneSolutionCellProliferationAssay200assaysG3582只用于实验室研究。包括:•4mlCellTiter96®AQueousOneSolutionReagent•1产品说明书产品规格目录号CellTiter96®AQueousOneSolutionCellProliferationAssay1,000assaysG3580只用于实验室研究。包括:•20mlCellTiter96®AQueousOneSolutionReagent•1产品说明书产品规格目录号CellTiter96®AQueousOneSolutionCellProliferationAssay5,000assaysG3581只用于实验室研究。包括:•100mlCellTiter96®AQueousOneSolutionReagent•1产品说明书储存条件:长期储存,–20°C避光保存。产品有效期请参见产品信息标签。频繁使用,4°C避光保存至6周。注意：实验证明此试剂冻融10次后与新鲜的试剂使用效果相同。安全性:就我们所知，此物质的化学、物理和毒理学性质还未完全研究清楚；因此，我们建议您在使用此试剂时，带手套，穿实验服并带护目镜。光敏感性:CellTiter96®AQueousOneSolutionReagent是一种光敏感的试剂，装在琥珀色的容器中。试剂暴露在光线下数小时后可能会发生褪色。这种褪色反应可能会导致490nm的背景吸光值轻微升高，但不会影响检测结果。3普洛麦格(北京)生物技术有限公司操作步骤用户提供：•96孔组织培养板•多道加样器（排枪），或连续式加样器，或数字式加样器•酶标仪III.A.一般操作步骤1.融化CellTiter96®AQueousOneSolutionReagent。室温静止90分钟或37°C水浴10分钟，应该可以完全溶解20ml的CellTiter96®AQueousOneSolutionReagent。2.在96孔板中，每孔100ul培养基加20µlCellTiter96®AQueousOneSolutionReagent。注:推荐以排枪或连续式加样器及数字式加样器加试剂，以保证加样方便准确。3.在37°C，5%CO2的环境下孵育1-4个小时。注:如果立刻检测就直接进行第4步，如果需要以后检测，每孔加入25ul10%SDS终止反应，避光保存于室温的湿盒中，昀多可保存18小时。然后再进行第4步。4.490nm读取吸光度值。III.B.应用举例：用B9细胞检测IL-6生物活性的操作程序1.B9细胞在含有5%FBS,50µM2-巯基乙醇(2-ME)和5ng/ml的重组IL-6的培养基中培养，每3天或当细胞浓度达到2×105cells/ml时，以2×104细胞/m的l细胞浓度传代培养细胞，并以IL-6继续处理。注:用于生物检测的B9细胞应该在昀后一次传代培养后的2天(以IL-6处理)。2.加50µl/孔的IL-6样品或标准品进行检测，以含有5%FBS和50µM2-ME的RPMI1640稀释。IL-6的标准液的初始滴定浓度4ng/ml在第12列，进行两倍系列稀释至列2(至4pg/ml)。(在下面的第5步加入细胞悬液后，滴定标准的终浓度将会变为从12列的2ng/ml到第2列的2pg/ml)。使用列1作为阴性对照：加入无IL-6的RPMI1640培养基(和附加成分)。在37°C，5%CO2的湿箱中平衡平板，同时收集细胞用于实验。3.在含有5%FBS和50µM2-ME的RPMI1640中离心300×g，5min洗两遍细胞。4.确定细胞数和细胞活力(通过台盼蓝染色法),以含有5%FBS和50µM2-ME的RPMI1640重悬细胞至1×105细胞/ml的终浓度。5.每孔加50µl细胞重悬液(5,000个细胞)至第2步准备好的平板中。现在每孔总体积应为100µl。6.将平板在37°C，5%CO2的细胞培养箱中孵育48–72小时。4普洛麦格(北京)生物技术有限公司®AQueousOneSolutionReagent。8.在37°C，5%CO2的细胞培养箱中孵育1–4小时。注:如果立刻检测就直接进行第9步，如果需要以后检测，每孔加入25ul10%SDS终止反应，避光保存于室温的湿盒中，昀多可保存18小时。然后再进行第9步。9.490nm读取吸光度值。10.绘制曲线：经校正的吸光值在Y轴，生长因子浓度在X轴。确定昀大吸光值（峰值）和昀小吸光值（无生长因子对照）差值的一半所对应的X轴值；该值即为ED50值(ED50=产生半数昀大反应的所必需的生长因子浓度)。IV.通常需考虑的因素IV.A.背景吸光度在以CellTiter96®AQueousOneSolutionReagent孵育后，细胞培养基中会在490nm有微量的自发产生的吸收光。使用的细胞培养基种类，血清种类，pH和暴露在光线下的时间长度都可能会影响490nm的背景吸光度值。孵育4小时后，背景吸光度值通常在0.2–0.3吸光单位。背景吸光度可能受某些带四唑还原反应的化合物的影响。强还原物质，包括维生素C,或含巯基的化合物,如谷胱甘肽，辅酶A和二硫苏糖醇,能够以非酶的方式还原四唑盐，从而导致背景吸光值的增加。高pH的培养基或长时间暴露在直接光照下面也可能导致自发的四唑盐还原反应的加速进而导致背景吸光值的增加。如果使用含酚红的培养基，快速的颜色变化可能指示待测化合物引起的pH值变化。待测化合物产生的特异的化学干扰可以通过检测对照孔(含有不同浓度待测化合物的培养基，但是不含细胞)的吸光度来确定。490nm的背景吸光度值可用下述方法校正:准备3个重复的对照孔(无细胞)，含有与实验孔同样体积的细胞培养基和CellTiter96®AQueousOneSolutio