双酶切连接反应之全攻略(

原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）转自医学教育网的一篇贴子，很精彩，希望大家有做到的一定仔细看看，也添加了一些自己的体验。希望大家继续补充双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：。双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（Xpmoles×长度bp×650）/1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20μl的连接反应体系中，6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350U/μl，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。3、转化：a、全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。c、加入890μlAMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。取100μl铺板。也可离心后余100μl几个非常重要的问题1做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.2对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干3对照的设立：为验证双酶切是否成功,可做如下对照:A酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时,也要进行对照.设4个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。。。。。。希望大家不断补充。Ding一下，和我的方法差不多。连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。长片段的连接步骤：1.载体加目的片段按一定比例混匀，置于50度水浴5min。2.马上冰浴2-5min，再加入Buffer,T4连接酶。（该Buffer中含有连接所需要的ATP，不稳定所以Buffer要分装不要反复冻容，其中连接酶的量不要超过体系的10%）3.将上述混合液放冰浴中约30min，直到温度回到室温。（T4连接酶在0-37度都可以起作用，放少量的冰水中，冰水慢慢的升温，期间会有一个最佳的连接温度，然后16度连接过夜）springwelwrote:用2周重组了14个质粒。这个效率非常不错！佩服！smartkevinwrote:Ding一下，和我的方法差不多。连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。这个操作是什么原理？为什么要选择45C？其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。springwelwrote:酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。[color=red]但是公司给推荐的一般都是2。0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，在20ul只加0.5ul酶，切的也很好。我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamdaDNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。smartkevinwrote:其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。不知道还有没有其他的解释？我倒是没有仔细看过分子克隆。mybbffwrote:如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。不知道还有没有其他的解释？我倒是没有仔细看过分子克隆。刚才查了一下分子克隆3，只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合”（中文版p71）。其实如果是粘性末端酶切的话都是有用的，无所谓非同源和同源末端，就算是非同源末端，载体和载体，片段和片段也能聚合。对于平末端应该就没有什么作用了。autumnsunwrote:但是公司给推荐的一般都是2。0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，在20ul只加0.5ul酶，切的也很好。我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamdaDNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。如果100ul里的DNA太多了也不行啊，酶和DNA还是要匹配的我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamdaDNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。其实除了考虑酶浓度（每微升多少个单位）以外，还应该考虑这种酶在lamdaDNA上的酶切位点数目。比如用HincII和XbaI双切pUC118，这两个酶在pUC118上都只有一个酶切位点，而在lamdaDNA上的酶切位点分别是35个和1个。根据酶活性的定义，相同单位的HincII和XbaI对pUC118的酶切效率是35比1，所以在双酶切体系中，所用的HincII显然应该要少很多。好！！！真实用！！！“回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.3pmol，后者取0.03pmol。”是不是应该前者0.03，后者0.3啊？精华！投你一票！msherwrote:好！！！真实用！！！“回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.3pmol，后者取0.03pmol。”是不是应该前者0.03，后者0.3啊？已经改了,谢谢!昨天14个测序结果出来，全部是阳性克隆。两边是载体的序列，中间是插入的目的片段。回顾自己的实验现补充几点。做转化时,也要进行对照.设4个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.就上面的对照简要说一下我的结果。转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆，约100个左右，我用的是直径6cm的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接用100微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的，长得克隆较大，很好挑选。下面简要的说一下对照的结果。A只长出了3个克隆，以100的基数计算，约为3%。即双酶切反应中质粒只有3%进行了单酶切B约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5%C长了很多克隆，证明操作系统没有问题。为系统控制指标。D长了很多克隆，证明感受态没有问题。这些对照相辅相成，扬长避短。万一什么都没作出来，也好分析原因。JM108感受态细胞的制备刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了10支。后来干脆自己做，感觉质量和TAKARA的质量不相上下，下面谈谈我制作感受态的体会。前期工作分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好前期工作非常重要，所谓‘磨刀不误砍材功’。注意事项1.不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种划板（AMP阴性）37度过夜培养，划板时用小TIP头挑少许冰渣即可，轻划S行。同时记得设立对照：A、在AMP阳性板划菌，排出AMP抗性菌