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细胞培养1cellculture细胞培养技术从生物体内取出组织或细胞，在体外(invitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研究，这种方法就是细胞培养（cellculture）。有时细胞培养也称为组织培养（tissueculture)。细胞培养目的和用途1、科学研究（1）药物研究开发，如新药筛选，疫苗、基因工程药物、细胞工程、药物研究与开发、单克隆抗体制备等（2）基础研究，如药物作用机理、基因功能、疾病发生机理等研究2、生物制药（1）疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫苗（肿瘤疫苗)等（2）基因工程药物生产：如EPO等（3）抗体药物、基因治疗药物生产（4）细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等（5）利用细胞法体外测定生物活性物质的活性；并预测其在体内的药效和替代体内法检测其成品的生物活性主要内容基本概念准备工作培养用液基本技术污染及防治肿瘤细胞的培养参考资源基本概念初代培养（primaryculture）又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物，一般持续1-4周。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。传代培养（subculture/passage）细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中,一般情况下可传代10-50次。也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。克隆（clone）从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（population）从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株（strain）再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，称为亚株（Substrain）cellline:原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系。如果不断继续传代或传代数有限，可称为有限细胞系（finitecellline）如果可以连续传代，则可称为连续细胞系（continouscellline）或无限细胞系（InfiniteCellLine）有恶性的无限细胞系：“恶性转化细胞系”只具永生性而无恶性的细胞系：无限细胞系或转化细胞系:NIH3T3、Rat-1细胞系细胞株cellstrain:由原代培养中，用选择或克隆，选出具有特征标记的细胞，经传代形成细胞株。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecellstrain）如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuouscellstrain）。细胞周期指细胞一个世代所经历的时间从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期反应细胞增殖速度体外培养细胞的种类和命名肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。细胞的命名无严格统一规定，多采用有一定意义缩写字或代号表示几种代表性的细胞名称：HeLa：供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究所（NationalInstituteofHealth）建立；每3天传代，每次接种3×105细胞／ml建立细胞系（或株）的要求原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可传代的细胞，需做如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的器官或组织。如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。2、细胞生物学检测：了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。3、培养条件和方法：应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。国内外相关细胞库国内细胞库武汉细胞库上海细胞库昆明细胞库成都基因治疗肿瘤药物工程技术研究中心细胞及载体服务南京中医药大学新药及海洋药物研究中心药理毒理研究室细胞库目录湖南远泰生物技术有限公司生物资源库上海午立生物技术有限公司细胞株中国医学科学院基础医学研究所细胞中心保藏细胞目录上海华大天源生物科技有限公司提供高表达GPCR细胞株和报告基因分析细胞系：中国工业微生物菌种保藏中心台湾快兴科技股份有限公司Cambrex產品台湾国家卫生研究院美国和欧洲细胞库ATCC（细胞株及胚胎干细胞库）1）下载细胞库目录：2）查询细胞株：3）胚胎干细胞库：CABRI(包括ECACC、DSMZ)://意大利I.A.Z.欧洲细胞实验室列表（大全）意大利IZSLER细胞库病毒德国PromoCell原代细胞=11lang=US细胞库ATCC:AmericanTypeCultureCollection(美国标准培养物收集所)ECACC:EuropeanCollectionofCellCultures(欧洲动物细胞库)JCRB:JapaneseCollectionofResearchBioresources(日本细胞库)CCTCC:ChinaCenterforTypeCultureCollection(中国典型培养物保藏中心)ATCCWHO的国际培养细胞文献中心ATCC液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株ATCC接纳入库细胞时，必须符合其入库标准，检测项目如下：培养简历冻存液细胞活力培养液细胞形态核型无污染检测物种检测免疫检测细胞建立者培养细胞的类型及其特点培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下生长，不需要贴附于支持物表面。包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞，如白血病细胞。每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）细胞接种后在培养液中呈悬浮状态此时细胞回缩，胞体呈圆球形10分钟～4小时游离期（悬浮期）细胞附着于底物上，游离期结束。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的糖蛋白（生长基质），这些促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。贴壁期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂潜伏期：6～24小时潜伏期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究对数生长期细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（ContactInhibition）。当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（DensityInhibition），导致细胞分裂停止肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。可作为区别正常与癌细胞标志之一。平台期1、无污染环境：保证细胞生存的首要条件2、恒定的温度：36.5℃±0.5℃3、气体环境：95%空气，5%二氧化碳混合气体4、细胞培养基：基础物质、生存环境(pH7.2-7.4、渗透压)培养细胞生存条件培养细胞的生存条件培养皿或培养瓶温度、湿度和气体由CO2恒温孵育箱提供生长培养液10～20％血清维持培养液2～5％血清营养物质糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等实验准备实验室设备器材实验器材处理细胞培养用液的配制实验室设计准备室（包括配液室）无菌室：缓冲间、操作间设备器材大型工具类超净工作台CO2培养箱倒置显微镜液氮罐酶标仪、微孔板震荡器消毒灭菌类紫外灯、压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸配液用具自动双重纯水蒸馏器，纯水仪制备细胞用品耗材：培养瓶，吸管，培养板，冻存管准备室的设备：蒸馏器酸缸烤箱高压锅储品柜（放未消毒物品）储品柜（放消毒过的物品）包装台配液室的设备：扭力天平和电子天平PH计磁力搅拌器培养室的设备：液氮罐低温冰箱（-80℃）CO2孵箱（孵育培养物）二氧化碳缸瓶4℃冰箱（放serum和培养用液）日光灯和紫外灯储品柜（存放杂物）水浴锅边台（书写实验记录）空气净化器系统三氧消毒杀菌机空调必须放在无菌间的设备：离心机超净工作台倒置显微镜压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：用干玻璃器皿消毒（160℃，2h）滤器：过滤法除菌：大多数培养用液(人工合成培养基、血清、酶液等)超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒超净工作台工作原理利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。滤器CO2培养箱设定条件为37℃，5％CO2使用时应注意：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气②保持培养箱内空气干净。定期消毒③箱内灭菌蒸馏水3L蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发数码型倒置荧光显微镜CFM-550Z自动双重纯水蒸馏器纯水仪酶标仪微孔板震荡器培养板培养瓶器械的清洗和消毒实验器材处理刷洗→包装→消毒灭菌消毒和灭菌干烤160℃，