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Vero细胞传代培养实验报告一、实验原理体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。二、器材和液体的准备①.细胞培养器材：培养箱、超净工作台、倒置显微镜、25m培养瓶、5ml移液管、1ml枪头；②.细胞培养溶液：配制好的PBS液、DMEM培养液（10%血清）、胰酶溶液。（均已过滤灭菌，37℃预热）③．其他器材及灭菌用品：计时器、无菌手套、75%酒精、镊子、棉球、废液缸。三、实验操作①．将长成单层的Vero细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中吸出瓶内的培养液，加入3~5ml的PBS溶液洗涤一次后吸出，加入1ml胰酶溶液，左右晃动培养瓶使胰酶溶液平铺在细胞表面。放入37℃，5%二氧化碳培养箱中放置3分钟。②.在倒置显微镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液吸出，加入2ml新鲜培养液，反复吹打，制成细胞悬液。③．将细胞悬液吸出1ml废弃后，将培养瓶中培养液添加至5ml左右，盖好瓶塞，送回37℃，5%二氧化碳培养箱中，继续进行培养。④.记录细胞生长情况。四、无菌操作的注意事项①．在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。将要放入超净工作台的器材均需放入前喷洒75%酒精灭菌。操作前30分钟起动超净台紫外灭菌后打开吹风，酒精棉球擦拭超净工作台面。②.操作时，严禁说话。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后，将瓶盖放置在远离手的下方打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。从消毒的铁筒取用移液管中用手拿末端。取用溶液后，及时盖好瓶盖。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。③．实验操作完毕后，将未用完溶液瓶口封好，放入冰箱存放。酒精棉球擦拭超净工作台面。废液缸取出。整理后，关闭超净工作台。五、实验结果与分析一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。①．传代前Vero细胞细胞复苏后培养24h，细胞生长较稀疏，且培养瓶边缘处细胞生长数明显少于培养瓶中心区域。picture.1细胞复苏后培养24h（边）picture.2细胞复苏后培养24h（中）细胞复苏后培养48h,细胞生长较密集，培养瓶边缘处生长细胞与培养瓶中心区域差异不明显。picture.3细胞复苏后培养48h（边）picture.4细胞复苏后培养48h（中）细胞复苏后培养72h，,细胞生长密集，视野可看到明显圆点，判断为死细胞。此时可以进行传代培养。picture.5细胞复苏后培养72h（边）picture.6细胞复苏后培养72h（中）②．传代时Vero细胞胰酶处理后细胞，细胞呈圆形，粘连在培养瓶瓶壁。picture.7胰酶处理后细胞（边）picture.8胰酶处理后细胞（中）③．传代后Vero细胞picture.9传代后培养24h细胞（边）picture.10传代后培养24h细胞（中）picture.9传代后培养48h细胞（边）picture.10传代后培养48h细胞（中）