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专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段学习目标：1.理解PCR的原理。(重点)2.体验PCR这一常规的分子生物学实验的方法。(难点)3.了解PCR的应用。(重点)自主预习探新知1．PCR扩增的原理和过程(1)细胞内DNA复制过程的解析解旋：在____酶作用下，DNA两条链打开，形成两条DNA单链↓引物结合：在DNA单链____端，通过____________与DNA母链结合解旋3′碱基互补配对↓DNA聚合酶结合：DNA聚合酶与模板链结合，标志着单链合成开始↓子链合成：__________酶从引物____端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来↓后续加工：将____切去，并合成空缺处的DNA单链，再由__________酶将不连续的DNA子链连接起来，子链和母链再形成______结构DNA聚合3′引物DNA连接双螺旋(2)PCR技术的原理①PCR技术：即______________，是一种____迅速______________的技术。它能以极少量的______为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。②子链扩增：需要____，合成方向总是从子链的____端向____端延伸。多聚酶链式反应体外扩增DNA片段DNA引物5′3′③解旋原理：DNA的热变性原理。在_______________的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为____。当温度缓慢____后，两条彼此分离的DNA链又会重新__________。80～100℃变性降低结合成双链④条件ⅰ____：DNA的两条链。ⅱ____：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。ⅲ原料：A、T、G、C四种__________。ⅳ酶：______________酶，一般用耐高温的TaqDNA聚合酶。ⅴ其他条件：需要一定的____溶液和能严格控制温度的温控设备。模板引物脱氧核苷酸耐热DNA聚合缓冲(3)PCR技术的过程①变性当温度上升到90℃以上时，双链DNA____为单链。解旋②复性温度下降到50℃左右，两种引物通过____________与两条单链DNA结合。碱基互补配对③延伸温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据____________原则合成新的DNA链。碱基互补配对2．PCR的实验操作及操作提示(1)实验用具①PCR仪：该仪器能自动调控____，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个____水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。②微量离心管：总容积为______mL，实际上是进行PCR反应的场所。③微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。温度恒温0.5(2)实验操作程序准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上↓移液：用__________按照配方在微量离心管中依次加入各组分↓混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，使反应液________微量移液器混合均匀↓离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是使反应液集中在__________↓反应：将离心管放入________中，设置程序进行反应离心管底部PCR仪(3)实验操作注意事项①为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行________。②所用的缓冲液和酶应分装成____，并在_________储存。③在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须____。高压灭菌小份－20℃更换(4)DNA含量的测定①原理：利用DNA在___________的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。②计算公式：DNA含量(μg/mL)＝___________________________×稀释倍数。260nm50×(260nm的读数)1．判断对错(1)PCR技术利用的是碱基互补配对原则。()(2)PCR技术可用于基因诊断、判断亲缘关系等。()(3)PCR技术需在体内进行。()(4)PCR技术可能为变性、复性、延伸三个阶段。()提示：(1)√(2)√(3)×PCR技术是聚合酶链式反应的简称，是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术。(4)√2．PCR技术控制DNA的解聚与结合是利用了DNA的()A．特异性B．稳定性C．热变性D．多样性C[DNA分子在80～100℃的温度范围内变性，双链解开成单链；当温度缓慢降低时，又能重新结合形成双链。]合作探究攻重难PCR扩增的原理和过程[合作交流]1．什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？提示：所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。2．PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶？提示：不需要。3．PCR技术中需要的两种引物碱基序列相同吗？为什么？提示：不同。由于DNA两条模板链中碱基序列并不相同，引物需要分别与两条模板链进行碱基互补配对，因此DNA两条模板链在进行扩增时，需要的引物碱基序列是不同的。[归纳总结]1．生物体内的DNA复制与PCR反应的比较体内DNA复制PCR反应解旋在解旋酶的作用下，边解旋边复制加热至90℃以上时，双链全部解开不同点酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)引物一小段RNARNA或单链DNA分子片段合成子链一条子链连续合成，另一条子链不连续合成两条子链都是连续合成不同点温度体内温和条件高温相同点①都需提供DNA复制的模板②都需要四种脱氧核苷酸原料③都需要分别与两条模板链相结合的两种引物④子链延伸的方向都是从5′端到3′端2.PCR的反应过程(如图所示)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。特别提醒：(1)耐热的DNA聚合酶一般用TaqDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq(发现于美国黄石国家公园的一个热泉中)中分离得到的。耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用解决了高温使酶失活的问题，大大增加了PCR的效率，使PCR技术趋向自动化。(2)从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增(例如，若只有一个DNA作为模板，则复制n次后，DNA数目为2n)。[典题通关]多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历三十多次下述循环：95℃下变性(使模板DNA解旋)→55℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72℃左右延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是()A．在PCR的变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，DNA在人体细胞内复制时可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的C．延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高C[变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，DNA在人体细胞内复制时借助解旋酶来实现；根据碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四种脱氧核苷酸为原料；PCR过程所需温度较高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温的DNA聚合酶。](1)DNA的复性过程是不是两条母链重新螺旋化成为双链DNA分子的过程？(2)某DNA分子通过PCR技术扩增了n次，含某种引物的DNA分子数目是多少？提示：(1)不是，复性是指温度降低到55℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合的过程。(2)一个DNA分子经过n次扩增，共形成2n个DNA分子，其中只有两个DNA分子只含有一个引物(引物Ⅰ和引物Ⅱ)，其余的DNA分子同时含有两种引物，所以含某种引物的DNA分子数目为2n－1。有关PCR技术的下列叙述，不正确的是()A．聚合酶链式反应，是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似C．PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，只需提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸即可D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环均分为变性、复性和延伸三个阶段C[PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。]PCR技术的实验操作[合作交流]1．PCR循环过程中，变性温度设置95℃，时间设置30s的原因是什么？提示：变性温度过低，解旋不完全导致DNA不能扩增，变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。2．在PCR过程中，延伸的温度为什么控制在72℃？提示：在72℃左右时，TaqDNA聚合酶活性最高。在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA链。[归纳总结]1．DNA含量的测定DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：稀释—取2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，将样品进行50倍稀释↓对照调零—以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零↓测定—取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值↓计算—DNA含量（μg/mL）＝50×（260nm的读数）×稀释倍数2．PCR技术的应用(1)医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断。(2)对单细胞中的DNA进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制备无突变的DNA片段供遗传病患者基因治疗时使用。(3)法医学用此技术来鉴别罪犯或进行亲子鉴定。(4)古生物学用此技术分析古生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹。(5)在农业生物技术中，可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等。[典题通关]聚合酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由变性、复性及延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于PCR技术的叙述，不正确的是()A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变C[PCR技术是人工合成DNA的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。](1)PCR反应过程中最重要的就是温度控制，DNA变性、复性及延伸分别需要怎样的温度条件？(2)在教材P62中的PCR反应体系的配方中，除了有模板DNA、原料、引物、聚合酶等外，还要加入缓冲液，加入缓冲液的目的是什么？提示：(1)变性为95℃，复性为55℃，延伸为72℃。(2)维持PCR反应所需要的pH。使用PCR仪的具体实验操作顺序应为()①设计好PCR循环程序②按配方准备好各组分③用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分④进行PCR反应⑤离心，使反应物集中在离心管底部A．②③⑤④①B．①⑤③②④C．②③⑤①④D．④②⑤③①C[PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括将配方所需各组分放于实验台上)→移液→混合→离心→反应。因PCR仪是一种能自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。][课堂小结]知识网络构建核心语句归纳1.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。2．PCR反应需要DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。3．PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结