植物组织石蜡切片

植物组织石蜡切片的制作BIOX.CN2005-5-2514:04:43来源：生命经纬一、实验目的1．熟练掌握石蜡切片的方法。2．掌握永久制片的制作过程，为研究植物的内部结构奠定基础。3．学会植物内部结构的比较研究方法。二、实验器具与试剂1．器具石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。2．试剂10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。三、实验材料幼嫩植物各部分，根据季节选择材料。四、实验内容与方法石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。它是把材料封埋在石蜡里面，用旋转切片机切片，可以切出很薄的切片。凡是精细的工结构，大都用石蜡切片。全都过程如下：1．固定2．洗涤3．脱水与硬化4．脱酒精2．封埋6．切片7．粘片8．脱蜡9．染色10．脱水11.透明12．胶封（一）固定1．固定的意义：固定就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来的结构以供我们观察。良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。2．固定液的种类：固定液的种类很多，根据配制成分可划分为：(1)简单固定液：以一种化学药品配制的固定液。常用的简单固定液有：A．酒精即乙醇，用作固定液，常用纯酒精或95％酒精。酒精穿透力强，固定时间常在1小时以内。高浓度酒精有使材料收缩的作用。70％的酒精可作保存液。配制低度酒精必需要用普通酒精即95％的酒精，绝不可用纯酒精。酒精为还原剂，不能与铬酸、锇酸、重铬酸钾等氧化剂配合。酒精可使核酸，蛋白质及肝醣等发生沉淀，但能溶解脂肪及拟脂。B．福尔马林即甲醛，具强烈刺激性的气味，纯净的甲醛，为无色透明液体。固定用的浓度为4-10％甲醛也是强还原剂。不能与铬酸、锇酸等氧化剂配合。经固定后，材料变硬，通常不引起皱缩，但随后经过他种药剂处理时，就每每出现皱缩。所以甲醛一般不单独作固定，而与其他液体混合使用。C．醋酸：为无色透明的液体，刺激性极强，冷则凝结成冰，故又叫冰醋酸。醋酸以与水和酒精配成各种比例的溶液，所用浓度为0.2～5％，也常与其他固定剂配合使用。醋酸穿透性很强，单独使用，有使原生质膨胀的作用，故常与酒精，甲醛等合用，醋酸为固定染色体的优良固定液，因此固定染色体的固定液中，几乎都含有醋酸。(2)混合固定液：由几种药剂，适量配制而成。常用的有下列几种：A、F.A.A固定液(又称万能固定液)：[用途]这个固定液在植物研究上，应用最多，为植物组织最常用的固定液。固定时间，不受限制，短为24小时，长可延至数月或数年。野外工作，非常便利。并且固定的材料，不妨碍染色，但对染色体的固定不佳。材料固定后，用50％酒精洗涤数次。[配法]50％或70％酒精90毫升冰醋酸5毫升福尔马林5毫升柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制。B、卡尔诺氏(Carnoy's)固定液[用途]此液作组织细胞的固定，有极快的渗透力，固定根尖和花药只需40-60分钟。固定后用95％酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入70％酒精中保存。配法有两种：C．纳瓦兴(Navaschjn's)固定液[用途]此液在植物制片上应用甚广，是细胞学及组织学上一种优良的固定液。此液原来的配方已很少应用，现所用的都是改良液，且种类很多，如材料较柔嫩，含水量较多，可用配方I、Ⅱ；材料较坚硬，含水量较少，可用Ⅳ、V配方，其中配方Ⅱ对植物胚胎学制片特别适用。为了使用方便，常分别配成甲、乙两种基液，用时临时等量配合。固定时间为12-24小时，固定后用70％酒精洗涤数次。(二)洗涤材料固定后，药剂继续留在组织中，易使组织破坏，必须用水或酒精洗去。用什么去洗，可根据三条原则：1．凡用水溶液配制的固定液，特别是含有铬酸、重铬酸钾的固定液，一律用水洗。2．凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。3．如固定液中含有苦味酸．在70％酒清中停留稍久时，可除去黄色。如用升汞固定的材料，在洗涤时，须加碘液，可除去汞的结晶。（三）脱水与硬化材料洗涤后，其中含水，水与石蜡不能混合，必须洗去。去水用酒精，材料由水入酒精中，不能操之过急，须由低度酒精渐至高度酒精。通常由30％、50％、70％、80％、90％，每次须经半小时，材料大的，时间须延长。若暂时不能埋蜡、材料可放在70％酒精中保存，经久不坏。在高度酒精中，不能过久．因酒精能使材料硬化，过久则材料由硬而脆，切时易于粉碎。（四）脱酒精材料脱水后，材料中全含酒精，酒精与蜡也不能混合，仍须除去。脱酒精通常用二甲苯，材料由酒精入二甲苯，最好也渐次进行，先经纯酒精二甲苯混合液，再入纯二甲苯中，纯二甲苯须换一、二次才行。时间每次约半小时。二甲苯不仅脱去酒精，并且透明，所以又叫透明剂。（五）埋蜡埋蜡是把材料封埋在石蜡里面，便于切片。一方面材料太小太软封在石蜡中，石蜡硬度适中，靠石蜡支持，才能切成薄片。另一方面，材料封埋后，不仅材料外面包着蜡，材料内面所有空隙也都充满着蜡。这样，材料的各部分都能保持原来的结构与位置，切片不致发生破裂或其他变形。所用石蜡，质地必须纯净，溶点通常在48～56℃这个范围内，以52℃的石蜡用得更多。在材料不硬，天气不热时，宜用较低熔点的蜡。材料硬，天气热的情形下，宜用高溶点的蜡。石蜡选定后，将石蜡切成小块，置瓷皿中加热溶蜡，待石蜡近于全部熔化时，置于温箱中。在进行封埋的全部过程中，石蜡的温度，总以高于溶点2℃为宜，过低石蜡凝固，过高伤害材料。材料脱酒精后，要进行浸蜡，再进行埋蜡。浸蜡也宜于渐次进行，一般先用石蜡和二甲苯的混合液浸蜡，再用纯石蜡换一、二次，每次的时间，视材料大小而定，通常每次半小时，材料大，时间必须加长。在浸蜡的过程中，须注意温度，不能超过2℃以上。浸蜡后，须将材料封埋在蜡块中，通常以磅纸折成纸盒(如图所示)。在盒内底上，用软铅笔反书材料及日期等，然后把蜡倒入盒内，将材料移入纸盒中，依将所要切的方向，妥善排列，再以两手平持纸盒，移至冷水中，用口在蜡面上吹气，促其凝结，待蜡面凝成簿层时，将纸盒全部沉入。水冷凝后，将纸撕去，即获蜡块，至此埋蜡完成。折纸盒按下列顺序折叠：(1)折AA'及BB'；(2)折CC'及DD'；(3)折CE'与AE'、向外夹出EE'。同样折出FF'，GG'及HH'；(4)使CE'E与E'IE两三角形相叠，并沿E'C和EI重叠的折痕向后转折。同样折其余三只角；(5)折RIJF向外，同样折出GKLH，即折成所需的纸盒。（六）切片石蜡切片，用旋转切片机。一个旋转切片机，可分三个部分，一个是安装切片刀的部分，有调节刀片斜度和固着刀片的螺旋。一个是安装材料的部分，也有螺旋可以调节材料的位置。另一个是操纵在旋转中向前推进的部分，控制着切片的厚薄，是比较重要而复杂的部分。切片步骤：1．先将冷凝的蜡块，切成小块，粘固在小木头上。2．安装切片刀，刀的斜度，非常重要，最好先切除的蜡块试刀，以确定刀的斜度，一经调度适合后，就不要随便变动，以免每次试刀的麻烦。3．修整蜡块，刀片斜度调好后，将刀片移近蜡块，使小蜡块的下边与刀锋平行，然后把它固定，再转下蜡块．呈矩形才行。只有平整的蜡块，才能切出平整的蜡带。4．最后根据需要，调整控制切片厚度的机制。调度后，把它固定下来。上述四步骤完成后，就可进行切片，将切出的蜡带，平展于盒内以供粘片。（七）粘片材料切成薄片后，须将切片粘在玻璃片上，加热展开，这叫粘片。所用载玻片必须清洁才能使用。粘片时，需把胶液(或称粘贴剂)置簿玻片上，再取切片，浮置胶液上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃约1小时即干。常用的胶液有下列三种：(1)明胶液：这是粘片最常用的胶液，简便优良，配法是100毫升纯水中，加明胶4毫克，加热熔化，过滤即得。(2)梅氏蛋白质：鸡蛋清50ml甘油50m1水杨酸纳1g用蛋白与甘油搅拌，同时加入水杨酸纳，调匀过滤，应用时以滤液15滴，放入纯水50毫升中即得。(3)Land氏液：阿拉伯胶1克重铬酸钾0.2克纯水100毫升（八）脱蜡玻片烘干后，须将蜡脱去，才能染色，脱蜡用二甲苯，再经酒精入水中，而后染色，其顺序如下：二甲苯→1/2二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色以上各级约需5～10分钟。（九）染色染色的方法很多，视研究目的加以选择。现就研究植物组织和研究细胞分裂常用的两种染色方法介绍如下：1．番红与固绿色法番红用l％的水溶液，固绿用0.5％的酒精液(用95％的酒精配制)，染色步骤如下：讨论和注意点：(1)用番红和固绿这个组合染成的切片，木化、栓化和角质的细胞壁，被番红染成鲜红色，纤维素的细胞璧，被固绿成绿色。就维管束来讲，木质部染红，韧皮部染绿，区别极清楚。(2)在50％酒精中脱色，需经实践，如脱色不够，绿色难得染好，脱色太过分，做出来的切片，红色太淡，甚至于全是绿色，失掉了二色染法的用意。(3)染色时间，不是绝对的，常因材料种类，切片的厚簿而不同，在没有把握时，最好选用少数材料试染，试染成功后，再依次大批染色。2．海氏铁矾—苏木精染色法：海氏铁矾—苏木精染色法的特点，是在染苏木精以前，用铁明矾做媒染剂，在染苏木精以后，又用铁明矾液鉴定(脱色或分色)。所用铁明矾液，为2～4％的水溶液，此液须在用前数日临时配制。配成后不能见光，须置暗处，或用有色玻瓶装。也不能保存太久，大约二月内可用，用时，每次更换。所用苏木精液，为0.5％的水溶液。此液配成后，须经1～2月，待它氧化成熟以后才能应用，故必须先配制。苏木精在水中溶解很慢，约需10日才能完全溶解，若需用不急，可直接用蒸馏水配制。若想加速溶解，可先用酒精溶解，再加入蒸馏水。苏木精0.5克酒精10毫升蒸馏水90毫升染色步骤如下：此染色法在细胞学及胚胎学制片上应用很广，是显示细胞一般结构及细胞分裂的优良染色液，染色结果可使染色体呈兰黑一—紫色，细胞质染成浅兰色或浅灰色。在染色过程中所需注意的是：①分色后，用水洗净铁矾液，最好用流水，如无流水，须多更换水。若冲洗不净，将来继续褪色。②在铁矾液中分色，须时常取出在显微镜下检查，到细胞质的染色很淡即止。（十）脱水、透明、胶封脱水用酒精，由低浓度酒精至高浓度酒精依次进行，最后入纯酒精更换一次，用二甲苯透明，用树胶封片，其步骤与前面所述永久制片相同。