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第1讲微生物的培养与利用[考纲要求]1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。4.利用微生物进行发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用。5.运用发酵加工食品的基本方法。6.测定食品加工中可能产生的有害物质。1．培养基营养成分的分析方法(1)虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。(2)在微生物所需要的化合物中需要量最大的是碳源，新陈代谢同化作用类型的划分也是以是否能合成含碳有机物为依据，能合成含碳有机物的是自养型，反之则为异养型。(3)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源又是氮源。2．微生物的培养和纯化(1)为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物学实验一般会设置空白对照：随机取若干灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。(2)观察菌落需用固体培养基，因此培养基要添加琼脂。(3)倒平板的温度一般在50℃左右较为适宜，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。(4)平板需倒置，这样既可减少培养基表面的水分挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成培养基污染。(5)平板划线法只适用于微生物的提纯，不适合进行计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。(6)利用稀释涂布平板法的计算公式估算水样中的活菌数：(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。(7)菌种可采用甘油管藏法长期保存。3．利用微生物加工食品的误区(1)误认为泡菜制作过程中乳酸和亚硝酸盐的含量都是先增加后减少。实际上，泡菜制作过程中乳酸的含量是先增加后保持稳定。(2)误认为果酒、果醋制作过程中都需要无氧条件。果醋制作过程中，利用醋酸菌的有氧呼吸，因此需要有氧条件。1．可以用血细胞计数板直接统计自来水中的大肠杆菌数()2．高压蒸汽灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，再开启锅盖()3．腐乳制作中，控制发酵温度的主要目的是调味()4．腐乳制作后期加入香辛料和料酒有防腐作用()5．果酒发酵中期通入氮气，酵母菌将从有氧呼吸转变为无氧呼吸()6．果醋的发酵周期与实验设定的温度密切相关()7．通常使用液体培养基分离获得细菌单菌落()8．在制作果酒的实验中，将葡萄汁装满整个发酵装置()9．泡菜制作的过程中，乳酸菌能在缺氧条件下产生乳酸()答案1.×2.×3.×4.√5.√6.√7.×8.×9.√1．吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝(匍匐菌丝)，它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。2．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。3．在平板划线操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环的目的：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端。考点一微生物的培养、分离与计数1．无菌操作技术(1)常用的3种消毒方法——煮沸消毒法、巴氏消毒法及化学药剂消毒法。(2)常用的3种灭菌方法①灼烧灭菌——接种环、接种针等金属器具；②干热灭菌——主要针对玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等；③高压蒸汽灭菌——主要针对培养基等。2．平板划线法、稀释涂布平板法及显微镜直接计数法的区别(1)平板划线法适用于微生物的纯化，但不能用于微生物的计数。(2)稀释涂布平板法常用于活菌计数，而显微镜直接计数法不能区分菌体的死活。(3)用稀释涂布平板法进行计数时，为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300间的平板进行计数。3．选择培养基及鉴别培养基的使用方法(1)分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。选择培养基中无凝固剂，为液体培养基，以纤维素作为碳源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；利用液体培养基能使营养成分充分利用，以增加纤维素分解菌的浓度。(2)鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，可在培养基上形成肉眼可见的菌落。刚果红染色法就是应用的此类培养基。4．微生物计数的“两”种方法(1)直接计数法：显微镜直接计数法。(2)间接计数法：稀释涂布平板法(活菌计数法)，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。考向一微生物的分离和培养技术1．(2019·全国Ⅲ，37)回答下列与细菌培养相关的问题。(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是_________________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上________(填“能够”或“不能”)生长，原因是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。答案(1)蛋白胨不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同能够硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源(2)倒置(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征(4)灭菌解析(1)细菌培养时常用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏能提供碳源、氮源、磷酸盐、维生素，蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO3不能为微生物提供碳源。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH是不同的，应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是化能自养型细菌，可以空气中的CO2为碳源，因此在没有碳源的培养基上能够生长。(2)在平板培养基上培养细菌时，一般需将平板倒置，这样可以防止皿盖上的水珠落入培养基。(3)不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同种细菌在一定培养条件下表现出各自稳定的菌落特征，可以作为菌种鉴定的重要依据。(4)使用后的培养基在丢弃前需进行灭菌处理，以免污染环境。2．(2019·泉州市3月质检)研究人员从大熊猫粪便中分离纤维素分解菌的实验流程如下图。请据图回答下列问题：(1)进行步骤①的目的是__________________________________________________________；液体培养基A应含有纤维素粉，其作用是__________________________________________________________________________________________________________________(答出两点)。(2)步骤②的操作是______________________________________________________________，以让纤维素分解菌被_____________________________________________________________。(3)鉴定纤维素分解菌时，培养基用______________染色。根据__________________________，评定菌株的产酶能力。答案(1)增加纤维素分解菌的浓度提供碳源、对纤维素分解菌有筛选作用(2)梯度稀释(或“系列倍数稀释”)分散成单个细胞(3)刚果红菌落产生的透明圈直径大小解析(1)题图中步骤①是将大熊猫粪便接种到液体培养基中进行培养，是为了增加纤维素分解菌的浓度；纤维素分解菌需要碳源，故要加入纤维素，另外只以纤维素为碳源可以作为筛选纤维素分解菌的指标。(2)题图中步骤②是对纤维素分解菌进行梯度稀释处理，是为了让纤维素分解菌分散成单个细胞。(3)可以采用刚果红染色法来鉴定纤维素分解菌，培养基需要用刚果红染色。刚果红会与纤维素形成红色复合物，若纤维素被分解，则在菌落周围会形成透明圈，故可以根据菌落产生的透明圈直径大小，评定菌株的产酶能力。考向二运用培养基进行微生物的筛选和纯化3．(2019·全国Ⅰ，37)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5g/L)。Ⅱ号培养基：氯化钠(5g/L)，硝酸铵(3g/L)，其他无机盐(适量)，X(15g/L)。Ⅲ号培养基：氯化钠(5g/L)，硝酸铵(3g/L)，其他无机盐(适量)，X(45g/L)。回答下列问题：(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是__________________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会__________________，其原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是__________________。(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供________和__________________。答案(1)牛肉膏、蛋白胨X(2)下降不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖(3)稀释涂布平板法(4)能量合成其他物质的原料解析(1)牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物生长提供了氮源，而Ⅱ号、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有机物是X。(2)因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，属于选择培养基，只有能降解X的细菌才能增殖，而不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖。(3)要对菌落进行计数，应采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸参与细菌的有氧呼吸，可以为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。4．(2019·福州质检)研究表明，香菇含有多种有效药用成分，其提取物有抗菌、抗肿瘤等多种功能。为研究香菇中的酚类物质对不同菌种的抑菌活性，科研人员进行了如下实验：(1)根据香菇中酚类物质具有____________的特点，可采用萃取法提取。(2)制备大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌的菌液。(3)用____________法将3种菌液分别接种在固体培养基上，使其均匀生长。(4)将浸透____________的无菌圆纸片分别贴在各个平板上。(5)将完成步骤(4)的平板置于恒温培养箱中进行培养，不同平板的培养温度不一定相同，原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________