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石蜡切片、HE、免疫组化实验一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈）①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。）②脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡Ⅰ1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡Ⅱ中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。③包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡Ⅱ倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。包埋过夜。④切片：将包埋好的蜡块取出，置于小木块上，用刀修成梯形（包埋时组织所在的底面现在变成正面，主要修这一面，蜡块厚的一面用烧过的刀块烫平，贴在小木块上，贴紧底面后，用刀片烫一下四边，使蜡块完全固定在小木块上，防止切片时掉落）（组织蜡块的梯形上下边一定要平行，梯形不用太大，也不能太小，保证组织在梯形中央，此时应有三个平面，木块平面、石蜡平面、组织梯形平面）（切的时候，切出的薄片应垂直向下走，如果是扇形或很乱的话，说明梯形上下边与刀片这三边不平行，可以调一下固定蜡块的地方，使三边平行。）切成5-7um厚的切片，左手轻轻转动小毛笔将切出的组织条带置于纸上，用锋利的刀切四五个梯形置于聚水玻片上，（用针轻轻挑上去）（切时，快、准、狠，不要多次切来切去，一刀切）（聚水玻片置于烘烤机上，先滴几滴水，等组织完全展开后，从侧边轻轻倒掉水，不要把组织倒掉了，然后用滤纸弯曲一下，以贴膜的手法，轻轻吸去多余的水分）显微镜检查切片状况，符合要求的，40℃烘烤过夜（14-18h之后便可保持了）二：HE染色①将做好的切片置于55℃烤片台烘烤1h（烤片台温度升到55℃时才计时，片子用一个盖子盖住，防止散热，不要碰到组织就行，没有烤片台时，恒温加热的地方都行，）（这一步主要是将蜡融化，便于后面将组织内有机相置换成水相）②（提前将二甲苯拿到烤片台旁边，防止石蜡又凝固了）切片置于二甲苯（10min/次，两次）（放置切片的时候，一般将有组织的一面朝向玻璃罐内侧，防止组织被划掉）；100%、90%、80%、70%、50%酒精（5min/次，一次）；去离子水（5min/次）（纯净水也可以）。③（置于水中这段时间可以延长，便于准备后面步骤所需试剂），将切片组织周围部位用滤纸擦干，用PAP蜡笔沿着组织画一个框，滴加苏木精染色30s（苏木精染细胞核的，回收苏木精，节约试剂），染完后立刻置于纯净水中，洗去苏木精（大概没有蓝色浮出就行），置于氨水中返蓝1min（30ml纯净水中滴加8滴氨水），盐酸分色3s（30ml纯净水中滴加3滴HCl），氨水再反蓝3~5min，纯净水5min（显微镜下观察苏木精是否染上了，如果蓝色太浅，从新染一次）（不同组织苏木精染色时间有所差异，应根据组织自行调整时长）。④50%、70%、80%、90%，各一次；100%酒精两次（1min/次）（将组织中水相置换成有机相）（这里不能用一开始那一批酒精了，因为之前那些里面含有蜡，用新的酒精）⑤（酒精脱水后，将玻片置于纯净水中，准备后面所需器材）伊红染色10s，将玻片置于100%酒精1min（时间不定，具体看苏木精颜色有没有变浅，显微镜下观察有没有染上伊红以及是否染得太过，如果染得太红，再次置于酒精中，可以多次操作），待染色比较满意后，置于二甲苯（3min/次，两次）（一般这种两次的，都是将试剂分装，不能同一个玻璃罐放6min当成两次）⑥中性树胶封片（中性树胶可以用二甲苯稀释一下，稀一点容易封片）（封片时，将盖玻片用丝巾擦干净，置于滤纸上，取玻片，倒扣在盖玻片上，注意轻轻贴，不要产生气泡，有气泡需要排出去），封片后，平台放置几分钟，保存。三：免疫组化使用的试剂这些，一般都是现配现用。抗体配置后，晃匀。（1）第一天①将做好的切片置于55℃烘烤1h。②切片置于二甲苯（10min/次，两次）；100%、90%、80%、70%、50%酒精（5min/次，一次）；去离子水（5min/次）（注意事项与HE一样）（这之后的所有步骤，都不能让切片干了！！一旦干片，后面的抗原抗体结合不充分，也会影响后面显色）（将切片置于塑料的切片架中，置于装有柠檬酸钠的烧杯里，动作快，不要让切片干了，不能用铁架子，因为要放微波炉中修复）③柠檬酸钠微波修复10min（柠檬酸钠修复液：无水柠檬酸0.18g、柠檬酸三钠二水1.47g、纯净水500ml，现配现用，不能使用两次）（微波炉中修复时，切记不能让修复液沸腾，不然组织会被煮掉了，微微沸腾后，调到低火修复，才开始计时），（修复的目的是释放出之前被4%PFA固定保护住的蛋白，不然后面抗体找不到反应的东西，修复时间根据选择的抗体而定。）修复后将烧杯自然冷却到室温，然后置于1xPBS中静置5min。④将切片置于3%双氧水中15min（目的是为了去除内源性的过氧化物酶，后面要加外源性的过氧化物酶标记物，防止内源性过氧化物酶的干扰，消除假阳性。）（双氧水这些试剂现配现用，30%双氧水取3ml置于27ml的85%甲醇中，这里为什么要用甲醇来稀释不用水？）⑤将玻片置于1xPBS中静置5min，三次。（期间不用取出玻片，轻轻倒掉PBS，缓缓加入就行，动作要快）（目的是洗去双氧水）⑥将玻片取出，用滤纸擦去组织周围多余水分，用PAP蜡笔围着组织画一个框，置于湿盒中（盒子里加一点PBS，覆盖住底部，目的是为了保证湿度，防止干片）（动作快，不能让组织干了），用移液枪滴加几滴Blockingsolution封闭液（不用太多，不能太少，覆盖住全部组织块后追加两滴），置于室温下封闭1h（不同封闭液封闭温度不同，根据一抗的种类选择封闭液）（封闭液的目的是，遮挡住一抗的非特异性抗原，只暴露一抗特异性抗原和一抗结合。）（封闭液常用10%的马血清，封闭温度37℃）⑦封闭之后，滴加几滴一抗，4℃孵育过夜（14h左右）（一般来说，一抗的选择就是根据组织来定，比如我们选择的是小鼠，那一抗就是抗小鼠某个特定蛋白的抗体，无所谓来自什么动物，比如我可以将小鼠血清注入马，就可以得到马源抗小鼠抗体）（一抗配置时，一抗：封闭液的比例是1：1000，）（2）第二天①用移液枪吸取切片上剩余一抗，用PBS洗涤三次，每次5min。（为了避免干片，所有放在PBS里这一步都可以适当延长时间，准备下一步的东西）②将切片拿出后，用滤纸擦干组织周围和缝隙内多余水分（防止稀释BSA浓度），移液枪滴加用1xBSA稀释生物素标记的二抗（1%BSA：二抗=1：200），覆盖住组织，室温下放置40min。（BSA用1xPBS稀释成1%浓度）（二抗抗一抗来源，比如一抗是马源抗小鼠抗体，则二抗应该为抗马抗体）③将切片置于1xPBS洗涤3次，每次5min。（把没有结合的二抗洗去）④与②步骤相似，用1%BSA稀释辣根过氧化物酶标记的链亲和素（1：200），室温孵育40min。（相当于三抗）（这就是为什么第一天要加双氧水祛除内源性过氧化物酶的原因）⑤将切片置于1xPBS洗涤3次，每次5min。（把没有结合的三抗洗去）⑥在洗涤切片期间，配置DAB（用DAB浓缩液与DAB底物按7ul：1ml的比例配制，配完震荡摇匀，13000r/3min）（DAB目的是与过氧化物酶结合）⑦配置好后，将切片移到有显微镜旁边，擦干组织周围水分（注意正反面，不要擦到组织！！！），滴加DAB液体，显微镜观察信号强弱（一般30s之后便能看到信号，不能染色超过2min，不然非特异性信号太强，整张片子都是信号）（看到信号之后，将切片放在1xPBS中，洗去DAB液）⑧与HE染色相似，苏木精30s，洗去苏木精，氨水返蓝1min，盐酸分色3s，氨水再返蓝3-5min，纯净水3-5min。（然后显微镜观察染色效果）⑨50%、70%、80%、90%，各一次；100%酒精两次（1min/次）二甲苯两遍，一次3min（二甲苯目的是为了让切片看起来透明一点，便于显微镜观察）（所有从有机相到水相所用的下行梯度酒精和二甲苯，和从水相到有机相的上行梯度酒精和二甲苯，不能使用同一批，因为下行梯度里面含有蜡）⑩中性树胶封片，保存（与HE染色那里操作一样）