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细胞生物学前景与研究方法一、细胞生物学研究热点领域2018当前细胞生物学研究的热点领域中，你最喜欢的是哪些？2017叙述当前细胞生物学研究最集中的领域。课后习题第一章当前细胞生物学研究热点课题中你最感兴趣的是哪些？为什么？①细胞通讯和细胞信号转导高等生物所处的环境无时无刻不在变化，机体功能上的协调统一要求有一个在细胞间进行相互作用的机制，称为细胞通讯。在通讯过程中，细胞作为一个生命的基本单位，一个相对独立的系统，识别周围环境中存在的各种信号，并将其转变成细胞内各种分子功能上的变化，从而改变细胞内的某些代谢过程，影响细胞的生长速度，甚至诱导细胞的死亡，所以说明细胞信号转导的机制对生命活动将有着重要意义。近年来人们对信号分子受体跨膜信号转导系统及胞内信号转导途径等方面有了深入的认识，并认为细胞内存在着多种信号转导方式和途径，各种方式和途径间又有各个层次的交调控，是一个十分复杂的网络系统。比如，最近非常热门的cGAS-STING信号通路。是天然免疫系统的一个重要组成部分，功能是检测胞浆DNA的存在，并在反应中触发炎症基因的表达。DNA通常在细胞核中，异常定位在胞质中的DNA和肿瘤的发生或病毒感染有关。cGAS感知到本不该存在的胞质DNA后，催化生成cGAMP（环鸟腺苷酸分子），进一步激活接头蛋白STING从而介导免疫反应。对该通路的研究在病毒免疫、肿瘤检测中有重要用处，cGAMP也可以作为一种潜在的疫苗佐剂被应用。②细胞的衰老衰老是一个复杂的生物学过程。衰老涉及机体、组织器官、细胞和分子等多个层次的功能性衰退。随着年龄的增长，衰老相关慢性疾病的发病率逐步提升，其中包括心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病和恶性肿瘤等。这些疾病不仅影响着老年人的健康和生活质量，同时也为国家和社会发展带来沉重的负担。现代医学和生物学认为，衰老若能得到延缓，将可能从根本上抑制多种衰老相关疾病的发生。因此，深入探究衰老的本质、揭开衰老谜团、找到延缓衰老的“金钥匙”，已然成为生物医学界攻关的重点。同样，衰老涉及的信号通路在衰老的研究中也占有很大的比重。近来RIPK1（受体酪氨酸激酶家族重要成员，负责细胞凋亡、细胞程序性坏死、细胞炎症等生理过程的开启和调控）在神经退行性疾病中的调节机理被阐述，重要作用被阐述。③干细胞领域（去隔壁背）④跨领域研究随着细胞生物学研究的不断深入，跨领域研究近年来成为新趋势例如“免疫代谢”就是一个典型代表。“免疫代谢”主要研究免疫与代谢在生理及疾病中的相互影响，该研究方向目前在两方面取得了引人瞩目的进展：一方面，新近认为天然或获得性免疫系统参与了既往所认为的非免疫性疾病，如肥胖，产生代谢与免疫方面的异常，可导致对2型糖尿病、心血管疾病、癌症或神经退行性病变的易感。另一方面，免疫细胞，如淋巴细胞在多层面受到内部代谢的调节影响。深入阐明免疫与代谢相互作用的细胞分子机制，是目前急需解决的科学问题。二、细胞生物学研究的基本内容2016什么叫细胞生物学？叙述细胞生物学研究的基本内容2015举三个例子谈谈你对细胞学在未来生物学发展中的意义的看法（细胞学？）2011通过了解细胞生物学发展历史过程，谈谈自己对生命科学研究的认识与体会。课后习题分析细胞生物学学科形成的客观条件以及之后发展的主要趋势（1）细胞生物学的定义见名词解释。（2）细胞生物学研究基本内容：包括细胞结构和细胞的生命活动具体包括生物膜与细胞器；细胞信号转导；细胞骨架体系；细胞核、染色体及基因表达；细胞增殖及其调控；细胞分化及干细胞生物学；细胞死亡；细胞衰老；细胞工程；细胞的起源和进化。（3）细胞生物学发展的历史过程见讲义第一页“细胞生物学科的形成与发展”；三、研究方案设计2013应用细胞生物学基础理论与技术，设计实验研究某一基因的生物功能2011设计细胞生物学实验，研究某一新基因的生物学功能2010当获得一个新的基因如何研究其功能（生化）（一）研究某一基因的功能1.进行生物信息学分析目前，生物信息学分析已成为新基因功能研究首选和必用方法，其具有方便快捷和经济等优点。研究者往往可以从中得到与新基因功能有关的重要信息，初步推测基因的可能功能。（1）编码产物序列分析全长cDNA序列查找开放阅读框→推导蛋白质氨基酸序列→信号肽预测分析→蛋白质理化性质分析→预测其高级结构（2）序列同源性分析以新基因的cDNA序列，利用BLAST等软件来对基因组数据库进行同源性比对，获得与其完全同源的基因组DNA序列及其染色体定位信息等。（3）蛋白质功能域分析SMART等数据库分析蛋白质功能域2.体内表达规律分析要开展新基因功能的研究工作，首要的研究任务摸清新基因在体内的表达规律。包括从mRNA和蛋白质两个水平上来对其基因表达谱进行分析，即看其在各种不同的正常或病态组织细胞中是否表达以及表达的水平高低等。新基因在某一特定的正常组织细胞中的表达水平高往往提示其在其中发挥着重要作用，而新基因在相应的病态组织中的表达异常则提示与该病理过程相关的生物学意义。（1）mRNA水平的表达谱分析半定量RT-PCR，实时定量RT-PCR和NorthernBlot等检测mRNA的表达水平。（2）蛋白质水平的表达分析制备相应的抗体来检测其蛋白质终产物的表达情况，如该蛋白质表达的亚细胞定位、分子质量大小、聚体形式等。3.基因功能获得新基因功能研究的功能获得策略即通过将新基因直接导入到某一细胞或个体中，通过观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化来鉴定基因的功能，常用的方法有：（1）基因转染技术：通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中，并在细胞内表达。特定基因的克隆—将基因导入细胞并鉴定—筛选高表达转染基因的细胞—研究特定基因的功能（2）转基因技术：外源目的基因的分离——转基因载体的构建——导入受精卵或胚胎干细胞——转基因胚胎的培养和移植——转基因动物的检测鉴定和品系筛选——研究特定基因在体内的功能转基因通常是指将外源基因整合到基因组中，可以达到稳定表达的效果，不会随着细胞分裂丢失。而转染是将外源基因通过质粒载体导入细胞中，只能短期表达。4.基因功能失活通过观察某一细胞或个体在新基因的功能部分或全部失活后的细胞生物学行为或个体表型遗传性状变化来鉴定基因的功能。常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技术和基因敲除等。（1）基因沉默技术：RNA干扰技术（2）基因敲除技术：1)构建打靶载体、将载体导入ES细胞2)将载体导入ES细胞（胚胎干细胞）3)筛选进行了同源重组的ES细胞4)将基因敲除ES细胞注射入囊胚，形成嵌合胚胎，得到嵌合体小鼠，而后筛选培育阳性子代小鼠。全身敲除小鼠是指同源重组的方式替换掉靶基因，达到全身删除的效果。条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。5.基因编码产物相互作用蛋白的研究细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物。因此，确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物相互作用的上下游蛋白质分子，也是研究新基因功能的一个十分重要的方面。目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括传统的基亲和分析而建立的免疫共沉淀技术和酵母双杂交系统。（1）免疫共沉淀技术（2）酵母杂交技术2019请设计一个课题，研究某一细胞信号转导通路在某细胞功能中的作用（二）研究某一细胞信号转导通路（1）确定信号配体用ELISA、PCR等方法首先确定与之作用的化学信号配体种类。蛋白质表达谱检测：qPCR/Western/基因芯片/质谱/RNAsequencing生物学效应检测1.增殖2.死亡3.分化4.形态2014应用细胞生物学基础理论与技术进行实验审计，研究某一基因的染色体定位及该基因表达蛋白在细胞内的定位。（500-800字）（三）研究一个基因的染色体定位研究一个基因的染色体定位一般采取原位杂交的手段，即用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置。标记探针的方式分为：放射性标记、荧光素标记和生物素标记三种类型。一般常用的是FISH（荧光原位杂交）：即利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应靶DNA或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异性探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA或RNA分子在染色体或其它细胞器中的定位。具体步骤：1、样品采集（如载玻片涂层处理）2、样品固定3、脱水4、杂交5、洗脱6、检测结果：可使用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜等进行观察，结合相关软件，进行数据整理及分析。（四）基因表达蛋白在细胞中的定位（1）免疫荧光技术免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。①直接法将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。②间接法如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。（2）免疫电镜技术用电子致密物质等标记抗体，然后让其与含有相应抗原的生物标本反应，以电镜观察可见电子致密物质的所在位置，识别抗原、抗体反应的部位的方法称为免疫标记电镜技术。分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术、免疫胶体金技术。最常见的是免疫胶体金技术。（3）GFP构建融合基因，在荧光显微镜下观察应用DNA克隆技术，将GFP和目的基因构成融合基因。将重构的质粒转入适当的细胞系中表达融合蛋白。在荧光显微镜下观察荧光的分布和运动，从而研究蛋白的分布。