液氮保藏法

液氮保藏法液氮保藏法是目前保存微生物菌种最可靠的方法，多数国家级菌种保藏单位都采用此法。1准备安培管用于液氮保藏的安培管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安培管。安培管的大小通常使用75×10mm的安培瓶。2加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安培管塞上棉塞，在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌15min；若保存霉菌菌丝体则需在安培管内预先加入保护剂，如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌种块为限，而后再进行高压灭菌。3接入菌种将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安培管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安培管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。4冻结再将已封口的安培管以每分钟下降1℃的慢速冻结至－30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。5保藏经冻结至－30℃的安培管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为－150℃，液态氮为－196℃。6恢复培养保藏的菌种需要用时，将安培管取出，立即放入38～40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安培管，将内容物移到适宜的培养基上培养。此法除了适宜于一般微生物的保藏外，对于一些用冷冻干燥法都难以保藏的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞都可长期保藏，而且不易发生变异。缺点是需要特殊设备。关于液氮复苏样品的方法及建议：方法一：准备吸水纸两张，干净毛巾一条。1.在地面或是桌面上铺两层干净吸水纸。2.迅速从液氮罐中取出冻存管后，放在吸水纸上（注意一定要将冻存管放到，不要直立起来，因为直立起来的冻存管内液氮很难在短时间内挥发出来，而放平以后，液氮会快速从管缝隙中渗漏出来）3.用干净毛巾罩住冻存管样品（还是为了防止爆炸造成伤害），大约3-5min即可进行后续试验。纯属个人经验，希望对大家有所帮助。方法二：1.要按照冻存的严格步骤（将冻存管置于4℃30分钟----20℃60分钟----80℃过夜---液氮罐）一步步来。2.拧紧盖子后，还用白胶布缠一圈，普通药店有卖的。就是打吊瓶时候粘针头的那种白胶布。这样会好一些，不过仍然会进去点。从液氮罐里取出提篮时应缓慢，然后取出冻存管，室温下放十几秒（注意一定要将冻存管放到，不要直立起来。），用带棉手套的手拿着冻存管管盖处，置于37度水中融化。3.在整个操作过程中必须穿戴保护服，包括手套，脸罩等。纯属个人经验，希望对大家有所帮助。方法三：使用Nunc冻存管，机械密封的冻存管必须密封在保护袋中。Nunc提供CryoFlex密封管，热密封的聚乙烯管专门为Nunc冻存管密封设计。将冻存管在液氮液相中冻存而没有使用CryoFlex密封管是十分危险的，冻存管在液氮液相中冻存必须使用CryoFlex密封管进行热密封。警告：不要使用Nunc的冻存管在液氮液相,除非正确的将冻存管密封在NuncCryoFlexTubing(Cat.No.343958)中。若不正确使用冻存管，液氮会进入冻存管中导致压力上升，发生爆炸或者生物泄漏安全事故。正确使用方法可以参考NalgeNuncInternationalCryopreservationManual。当冻存管储存在液氮液相中而没有使用CryoFlexTubing时,复苏时应将冻存管从液氮液相取出后必须在液氮气相中储存24h，这样可以使得液氮从冻存管中慢慢的蒸发和逃逸，从而降低冻存管中的压力。等在液氮气相储存24h后，将冻存管放入水浴槽，同时用毛巾覆盖，等熔融复苏结束后转移冻存物。此方法也可在方法一及方法二中作为前处理使用。整个操作过程中必须穿戴保护服，包括手套，脸罩等。纯属个人经验，希望对大家有所帮助。