MTT实验

MTT实验----检测细胞活力、细胞增殖能力和细胞毒性刘畅2014.3.26细胞周期的变化肉眼不可见，如何比较不同细胞增殖的快慢呢？1.化疗药物不仅作用于癌细胞，也会杀死体内正常细胞，如何经济地检测某种化疗药物的毒性和适宜浓度？2.大规模的筛选抗肿瘤药物，耗时费钱，有没有经济快速的方法进行抗肿瘤药物体外筛选？3.人体内一些microRNA与细胞增殖密切相关，可以作为癌症早期诊断的分子标记，那么如何用体外实验证明这些microRNA在细胞增殖中的作用？（如：miR-29c在鼻咽癌组织中表达量低于癌旁正常组织，推测miR-29c能够抑制鼻咽癌细胞增殖，可进行MTT实验验证推测。）ScientificquestionsMTT实验IntroductionofMTT3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。-20℃储存，需避光（锡箔纸包裹），分装避免反复冻融。MTT有致癌性，用的时候小心,带手套。配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。MTT法原理MTT比色法：一种检测细胞存活和增殖能力的方法原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪490nm波长处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。MTT甲瓒SDHDMSO490nm测定OD值MTT实验步骤（示例：miR-29c对细胞增殖的作用？）6孔板转染24-48h后收细胞吸取10uL于细胞计数板中计数，计算所需细胞总量96孔板中每孔加入200uL细胞液，约1000个细胞12h细胞贴壁后，每孔加入20uL5mg/mLMTT，轻晃混匀，37℃培养4h，封口移去上清，每孔加入200uLDMSO（需避光），脱色摇床轻摇10min酶标仪（490nm波长）测每孔OD值6孔板细胞种板及转染长至80%左右收细胞各孔加1.75mL培基+0.25mL细胞悬液，轻吹混匀（十字交叉平移法+顺逆时针各10圈）种板转染Opti-mem125uLLip20005uLmix1Opti-mem125uLDNA1ugmix25min5min25min培养12-24h，吸去6孔板中培基，加入1.75mL新鲜培基+250uLDNA24-36h开始做MTT实验MTT实验步骤（示例：miR-29c对细胞增殖的作用）6孔板转染24-48h后收细胞吸取10uL于细胞计数板中计数，计算所需细胞总量96孔板中每孔加入200uL细胞悬液，约1000个细胞12h细胞贴壁后，每孔加入20uL5mg/mLMTT，轻晃混匀，37℃培养4h，封口移去上清，每孔加入200uLDMSO（需避光），脱色摇床轻摇10min酶标仪（490nm波长）测每孔OD值MTT实验—96孔板加样比较转入miR-29c的细胞和空载细胞6d中的增殖能力，各做5个重复。边缘各孔加200uLhanks液，防止蒸发。30*200uL=6mL30*1000=30000个MTT实验步骤（示例：miR-29c对细胞增殖的作用）6孔板转染24-48h后收细胞吸取10uL于细胞计数板中计数，计算所需细胞总量96孔板中每孔加入200uL细胞液，约1000个细胞12h细胞贴壁后，每孔加入20uL5mg/mLMTT，轻晃混匀，37℃培养4h，封口移去上清，每孔加入200uLDMSO（需避光），脱色摇床轻摇10min酶标仪（490nm波长）测每孔OD值MTT实验结果处理结果记录结果处理Graphpad大规模的抗肿瘤药物及其适宜浓度的筛选MTT实验应用细胞毒性试验MTT实验应用此外，MTT实验也应用于生物活性因子的活性检测、肿瘤放射敏感性测定等。特点：灵敏度高、经济。谢谢！