稀释平板计数法

实验十一稀释平板计数法实验目的学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。实验内容用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。实验器材酿酒酵母菌悬液马铃薯培养基1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。实验步骤1．无菌器材的准备(1)无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。(2)无菌移液管的准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1.5cm），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面的微生物吹入。棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。然后将移液管尖端放在4~5cm宽的长纸条一端呈45º角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。(3)无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。2．样品稀释液的制备(1)编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。(2)稀释用1m1无菌吸管吸取1m1己充分混匀的菌悬液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支1m1吸管插入10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液1ml，精确地放0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依次类推，整个过程如图所示。放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不准确，结果误差较大。3．平板接种培养平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。(1)浇注平板培养法1)取样用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5、和10-6的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。2)倒平板尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒人融化后冷却至45℃左右的培养基约15毫升／平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并己冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。(2)涂布平板计数法：平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置于的恒温箱中培养24—48h。涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。4．计数培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位(cfu)＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。实验结果及讨论1．实验结果将培养后菌落计数结果填入下表：稀释度10-410-510-6123平均123平均123平均cfu数/平板每ml中的cfu数2．讨论针对实验原理、步骤、现象进行讨论。实验作业1．为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？2．要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？3．试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。4．当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？5．用浇注平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间(48h)后观察结果？