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本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需word版本请发送站内信。 酵母转化手册 译自Clontech Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 User Manual（PT1172‐1） 目录 1.简介 2.组分内容 3.所需的附加材料 A．Clontech的Ready‐to‐Go Media Pouches B．培养基配方 4.酵母转化所需溶液 5.酵母菌株储存条件 6.酵母转化方法 A．方法：酵母感受态细胞的制备 B．方法：转化酵母感受态细胞 C．方法：涂板、判定转化效率 7.参考文献 图表 表1：酵母转化实验所需要的培养基组分 1.2. 3.本简介 Yeastmaker酵母细胞转杂交系统。此方法提供如果要筛文就越有可能是因为该方Plus液体培法，可以获 组分内容 所需的附加材A．ClontechClontech提供本手册仅供学习r™YeastT转化法，本方供了一种比常文库，较高的能发现新的、方法包含一个培养基培养获得≥3X1材料 h的Ready‐to供提供预先混习交流，不做其Transforma方法适用于所常规转化方的转化效率是、稀有的相互个特殊又重酵母细胞（105转化子/uo‐Go Media P混合好的培养表1酵母转其他用途，如ationSyst所有的酵母方法更为高效是必要的条互作用，此方重要的步骤：（帮助酵母细ug质粒DNPouches 养基，以方便转化实验所需需word版本请em2提供了母转化，包括效，转化效率条件，你的文方法之所以较在加入DNA细胞摄取更A。便使用 要的培养基组请发送站内信。了一种高效括酵母单杂交率更高也更文库包含的克较其他方法A和DMSO处多的质粒D组分 效的PEG/醋酸交系统和酵母更为可信的技克隆数越多法转化效率更处理后，加入DNA）。使用此 酸锂母双技术，，你更高，入YPD此方 本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需word版本请发送站内信。 B．培养基的配法 配置好的培养基溶于500mL ddH2O，121℃高压蒸汽灭菌15min，在使用前要降至常温，（液体培养基也可以过滤灭菌）。灭菌时间不能过长。 Clontech公司提供的预先混合好的培养基不需要调pH，但是如果配置使用的ddH2O偏酸性，就要将pH调到5.8。 关于培养基配置的更多细节可以查询Clontech Yeast Media Protocol‐at‐a‐Glance (PT4057‐2)。 4.酵母转化所需溶液 1.1X TE/LiAc 溶液 先配置母液：10X TE buffer和1 M LiAc (10X)，转化前再配置工作液，现配现用。 混合1.1 mL 10X TE buffer和1.1 mL 1 M LiAc (10X)，再加入8.8mL 灭过菌的超纯水，定容至10mL，混合均匀。 PEG/LiAc溶液（聚乙二醇3350/醋酸锂 溶液） 先配置母液：50% PEG 3350、10X TE Buffer和1 M LiAc (10X)，转化前再配置工作液，现配现用。 母液 工作液各组分要求的终浓度配置10mL 工作液所需各组分母液体积 50% PEG 3350 40% 8 ml 10X TE Buffer 1X 1 ml 1 M LiAc(10X) 1X 1 ml 0.9% (w/v) NaCl溶液 称取0.9g NaCl，溶解于80mL超纯水中，用容量瓶定容至100mL，过滤灭菌。 5.酵母菌株储存条件 如果想要了解更多关于酵母的知识，推荐去看Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, by Guthrie & Fink (1991) and Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts, edited by Heslot & Gailardin (1992). 酵母菌在用封口膜封住的YPD或YPDA培养皿上，4℃可以保持2个月。但是新鲜的菌种（1‐3周）接菌到液体培养基上后活力更佳。 新转化的酵母菌株的储存 1.如果要保存新转化的酵母菌株，用接种环（牙签）接种单菌落。 2.用包含15–30% 无菌甘油的0.5 ml YPD 或YPDA液体培养基（或者适宜的SD培养基）重悬菌体，接入2mL离心管 3.用封口膜封紧盖子，轻轻混匀，速冻后放入‐70℃冰箱保存。 4.如需使用该菌株，在冰上充分溶解后，挑适量菌液，在YPD 或YPDA固体培养基（或者适宜的SD培养基）上划线培养。（在划线前要充分混匀菌液） 本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需word版本请发送站内信。 6. 酵母转化方法 A．方法：酵母感受态细胞的制备 1.材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Cat. No. 630439) 1.1x TE/LiAc (Section 4) YPDA固体培养基 YPDA液体培养基 适宜的SD筛选培养基 酵母细胞 (S. cerevisiae)冷冻保存液 无菌（去离子）水（去离子水就是超纯水） 2.挑酵母菌株（Y1HGold）在YPDA固体培养基上划板，30℃倒置培养，待菌生长至适宜大小（约3天）。 注意：此时可以暂停实验，将平板转入暗下，4℃可保持1个月，待继续实验时将平板再放入30℃，菌落会继续生长。 3.挑单菌落（直径2–3 mm，储存时间4周），接种于有3 ml YPDA液体培养基的三角瓶（规格：15mL）中。 （温馨提示：同时挑4个单菌落，接种到4个三角瓶中，最后挑生长速度最快的菌落继续实验） 4.在30℃摇床中，以250rpm摇8–12小时。 5.转大瓶：吸取5uL菌液转入有50mL YPDA液体培养基的三角瓶（规格：250mL）中。 6.在30℃摇床中，以250rpm继续摇16–20小时，期间测OD，待OD600达到0.15–0.3时停止摇菌。 注意：一定要持续摇菌至OD值合适时停止，但培养时间不能过长。 7.室温下，700 g离心5 min收集菌体，弃上清，用滤纸吸干残余液体，加入100mL YPDA液体重悬菌体。 8.在30℃摇床中，以250rpm继续摇3–5小时至OD600达到0.4–0.5。 注意：一定要持续摇菌至OD值合适时停止，但培养时间不能过长。 9.将菌液分装至2个灭过菌的50mL离心管中，室温下700 g离心5 min收集菌体。弃上清，用滤纸吸干残余液体，2个离心管中各加入30mL 灭过菌的超纯水，重悬菌体。 10.室温下700 g离心5 min收集菌体。弃上清，用滤纸吸干残余液体，2个离心管中各加入1.5 ml 1.1xTE/LiAc重悬菌体， 11.将菌液分别转至2个1.5mL离心管中，高速离心15s。 12.弃上清，2个1.5mL离心管各加入600 µl 1.1xTE/LiAc，重悬菌体，酵母感受态细胞已制备好，可用于转化质粒DNA。 注意：为了使转化效率尽可能的高，感受态要现配现用，但是此感受态细胞在冰上储存几个小时并不会明显降低转化效率。 本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需word版本请发送站内信。 B．方法：转化酵母感受态细胞 1.材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 酵母感受态细胞(Section 6.A) PEG/LiAc (Section 4) 0.9% (w/v) NaCl DMSO 2.将下列组分加入到已经预冷的无菌离心管中，混合均匀。 Small‐Scale （1.5 ml tube） Library‐Scale （15 ml tube）质粒DNA（浓度、纯度高） 100 ng 5–15 µg* 变性的**Yeastmaker宿主DNA (10 µg/µl) 5 µl 20µl （* For example, use 5 µg of bait + 10 µg of prey for yeast two‐hybrid library cotransformation. ） （**变性方法： 用95–100°C 高温处理 5 min，迅速置入冰上数分钟，待温度降至4℃再重复一次此步骤） 加入感受态细胞，轻柔混匀 50 µl 600 µl 加入PEG/LiAc，轻柔混匀 500 µl 2.5 ml 置于30℃恒温箱孵化 30 min 45 min （注意：期间Small‐Scale每隔10min，Library‐Scale每隔15min，轻轻倒混几次） 加入DMSO，轻柔混匀 20 µl 160 µl 在42℃水浴锅中温浴 15 min 20 min （注意：期间Small‐Scale每隔5 min，Library‐Scale每隔10 min，轻轻倒混几次） 离心收集菌体 高速离心15s 700 g离心5 min弃上清，加入YPD Plus 培养基 1 ml 3 ml （注意：使用YPD Plus可提高转化效率50‐100%，此步骤不要使用普通YPD培养基） 30° C摇床震荡培养 可忽略此步骤 90 min 离心收集菌体 高速离心15s 700 g离心5 min弃上清，加入0.9% (w/v) NaCl溶液重悬菌体 1 ml 15 ml 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需word版本请发送站内信。 C.方法：涂板、判定转化效率 1.将菌液分别稀释10倍、100倍，分别吸取100 µl稀释液，涂布到相应的SD筛选培养基上。例如： pGBKT7载体用SD/‐Trp培养基 pGADT7载体用SD/‐Leu培养基 pGBKT7和pGADT7共转，用SD/‐Leu/‐Trp培养基 注意：不要直接用未稀释的菌液涂板。 2.30℃恒温箱倒置培养3–5天，待菌落长至适宜大小 3.用下列公式计算转化效率 转化效率=单菌落数X悬浮细胞液总体积（mL）涂板的菌液体积（mL)XDNA总量（ug)（如果是用10倍稀释液或100倍稀释液涂板，还要乘以相应的倍数）例如：转化100ngpGBT9空载体（YeastmakerYeastTransformationSystem2的阳性对照质粒），将1ml菌液稀释10倍，吸取100uL涂板，培养3天后，在SD/Trp上长出300个单菌落，其转化效率为：转化效率=300x1x10(稀释倍数）=3x105 cfu/μg0.1x0.1