基于活性的蛋白质组分析-王初

综述Review*E-mail:[e-mail]2,2015;publishedMay21,2015.ProjectsupportedbytheResearchgrants(No.81490740andNo.21472008)fromtheNationalNaturalScienceFoundationofChina.项目受国家自然科学基金委重大项目(No.81490740)和面上项目(No.21472008)资助.ActaChim.Sinica2015,73,657—668©2015ShanghaiInstituteofOrganicChemistry,ChineseAcademyofSciences基于活性的蛋白质组分析王初*,a,b,c,d,e陈南c(a北京大学分子科学国家实验室,b生物有机与分子工程教育部重点实验室,c北京大学化学与分子工程学院,d合成与功能生物分子中心,e北大清华生命科学联合中心北京100871)摘要众多物种基因组解码工作的完成极大地丰富了我们对这些生命体系组成复杂度的认知,然而下一个更为严峻的挑战是如何快速准确地解析这些基因编码蛋白的分子功能,这也是当前蛋白质组学领域亟待解决的一个重要科学问题.基于活性的蛋白质组分析是近些年来一项新兴的技术平台,它致力于在复杂的生命体系中系统地鉴定某类具有特定功能的蛋白质分子.在本篇短综述中,我们将对该化学生物学技术的发展做一个简要的回顾,重点介绍该技术在未知蛋白的功能解析、小分子抑制剂的筛选以及活性小分子靶标蛋白的鉴定等方面的工作,最后将对该技术未来发展的走向及其拓展应用做前瞻性的讨论.关键词活性分子探针;化学蛋白质组学;蛋白功能解析;抑制剂研发;靶点鉴定Activity-basedProteinProfilingWang,Chu*,a,b,c,d,eChen,Nanc(aBeijingNationalLaboratoryforMolecularSciences,bKeyLaboratoryofBioorganicChemistryandMolecularEngineer-ingofMinistryofEducation,cCollegeofChemistryandMolecularEngineering,dSyntheticandFunctionalBiomoleculesCenter,andePeking-TsinghuaCenterforLifeSciences,PekingUniversity,Beijing100871)AbstractGenomesequencingprojectshaverevolutionizedourviewofthecomplexityofprokaryoticandeukaryoticpro-teomes,however,wearealsoleftwithadauntingchallengeoffunctionallyannotatingtheselargenumberofpredictedpro-teins.Activity-basedproteinprofiling(ABPP)hasbeendevelopedasapowerfulchemoproteomictoolaimingatsystemati-callydiscoveringandassigningfunctionsofuncharacterizedenzymesdirectlyfromnativeproteomes.Here,wereviewedthedevelopmentandapplicationofthisemergingtechnique,mainlyfocusingonhowitwasappliedforfunctionalannotationofunknownenzymes,screeningandoptimizationofsmall-moleculeinhibitors,andtargetidentificationofbio-activesmallmolecules.Keywordsactivity-basedprobe;chemicalproteomics;proteinfunctionalannotation;inhibitordevelopment;targetidentifi-cation1引言根据GenomesOnlineDatabase(GOLD,)数据库的统计,截止到2014年底,接近8000个物种的基因组解码工作已经完成,另外有近12000个物种的基因组解码工作正在进行中.按照分子生物学中心法则,每一个基因都会通过转录和翻译产生与其相对应的蛋白质分子,因而与每个物种基因组对应的是其复杂多变的蛋白质组.近些年来,在基因组学发展的大力推动下,蛋白质组学的研究也如火如荼地开展起来[1～8].这些研究通过运用酵母双杂交[9,10]、二维凝胶电泳[11,12]以及生物大分子质谱[13～18]等技术致力于大规模分析鉴定蛋白质在生物体系内的丰度,定位以及和其它生物大分子之间的相互作用,获取了大量有价值的信息,极大地推动了我们对于生命体系复杂度的认知.然而,蛋白质作为生命过程中的各种重要功能的最终执行者,其在生物体内的活性经历着时间和空间上的严格调控,而这些活性的变化对一些生理和病理过程产生的影响通常比蛋白本身丰度的变化所带来的影响更大.因此,如何大规模准确迅速地在复杂生物体系内分析获取蛋白功能活性的信息成为了蛋白质组学亟需解决的一个重要科学问题.在蛋白质翻译表达后,生物体对其功能活性的调控往往是通过化学手段进行的,例如磷酸化修饰可以激活蛋白开启细胞内信号转导[19];泛素化修饰可以导致靶蛋白被蛋白酶体降解,维持生物物质平衡[20];乙酰化可以改变组蛋白与核酸分子之间的相互作用,从而调节基因表达[21].除了这些重要的翻译后修饰外,生物体内的许多蛋白酶都经历着从没有活性的酶前体到有活性的酶再到失去活性的酶-抑制剂复合体这样一个动态调节过程[22,23],而这样一个失活、激活再失活的过程也密切地反映了蛋白酶活性催化中心的化学DOI:10.6023/A15040223化学学报综述658©2015ShanghaiInstituteofOrganicChemistry,ChineseAcademyofSciencesActaChim.Sinica2015,73,657—668变化.因此,在蛋白质组水平上研究蛋白功能活性变化需要引入更多化学的技术和方法.在本篇综述中,作者将介绍一项叫做“基于活性的蛋白质组分析”(Activity-basedProteinProfiling,ABPP)的新兴技术[24],回顾该技术在未知蛋白的功能解析、小分子抑制剂的筛选、活性小分子靶标蛋白的鉴定以及后翻译修饰位点的发现等方面的工作,最后对该技术未来发展的走向及其拓展应用做前瞻性的讨论.2ABPP简介ABPP方法的核心是设计一个可以在蛋白质组内与某一类蛋白酶活性中心氨基酸残基发生共价反应的“活性分子探针”(Activity-basedProbe,ABP).由于ABP对蛋白的化学修饰是发生在决定其生物活性的催化中心的,因此我们可以通过该探针标记水平的高低在复杂的蛋白质组内即时读取这类蛋白酶的活性功能状态.如图1所示,ABP的设计通常包括两个基本组成部分:“反应基团”和“报告基团”,一般通过碳链或者聚乙二醇链将二者连接在一起.反应基团通常是具有独特化学结构的亲电性化学小分子,能够选择性地与蛋白质组中某一类蛋白酶的活性中心结合,并与其中执行重要催化功能的亲核性氨基酸发生反应,从而将探针分子共价地标记在靶标蛋白上.对于那些通过非共价结合方式与蛋白质发生作用的活性小分子,分子探针的设计则需要额外引入一个光交联基团.活性小分子作为探针中的“结合基团”可以特异性地识别靶蛋白并发生非共价结合,同时拉近了探针中光交联基团和靶蛋白的空间距离,经紫外光照射,光交联基团产生自由基并与空间邻近的氨基酸发生交联,从而实现了探针与靶蛋白的共价标记(图1).活性分子探针中的“报告基团”的作用是精确地反映出反应基团在蛋白质组中对靶标蛋白进行标记水平的高低,并可以将被探针标记的靶蛋白选择性地富集出来,通过后续实验方法加以分析和鉴定.活性分子探针中的报告基团通常也包括两类:一类是诸如罗丹明、荧光素、Cy3/Cy5等的荧光基团,当被探针标记的蛋白质组在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上分离时,被标记的蛋白就会显示出特定的荧光信号便于检测[24].另一类是生物素基团(Biotin),被探针标记的蛋白既可以通过免疫印迹法检测,还可以被特异的富集出来,然后通过生物大分子质谱进行分析,确定这些被探针标记的蛋白成分[25](图1).随着生物正交反应[26～29]的发展和创新,活性分子探针中的报告基团逐渐被惰性的生物正图1活性分子探针结构示意图，包括一个反应(或结合)基团(黄色)和一个报告基团(紫色),两个部分由中间的Linker连接在一起,Linker一般为碳链或聚乙二醇链;左侧列举了一些反应基团:丝氨酸水解酶抑制剂fluorophosphonate(FP),木瓜蛋白酶抑制剂E-64活性分子探针(E-64-based-ABP),蛋白激酶TypeII抑制剂活性分子探针(Kinase-ABP),基质金属蛋白水解酶抑制剂GM6001活性分子探针(MMP-ABP).其中FP和E-64-based-ABP结构中红色部分为活性反应基团,而Kinase-ABP和MMP-ABP中蓝色部分为光交联基团;右侧为报告基团的例子,如荧光基团罗丹明(TAMRA)以及可用于免疫印迹检测和亲和素(Avidin)富集的生物素(Biotin)基团Figure1Diagramofatypicalactivity-basedprobe(ABP),consistingofareactive(orbinding)group(yellow)andareportergroup(purple),whichareconnectedviaalinkerthatiscommonlycomposedbyacarbonorpolyethyleneglycolchain.Examplesofselectedreactiveorbindinggroupsareshownontheleftincluding:Fluorophosphonate(FP)ProbesforSerineHydrolases,E-64-basedABPsforthepapainclassofcysteineproteases,ABPsbasedonTypeIIATP-competitiveinhibitors,photoreactivehydroxamate-basedABPsformetalloproteases.InthestructuresofFPandE-64-basedABPs,reactivegroupsarecoloredinredandinthestructuresofKinase-ABPandMMP-ABP,thephoto-crosslinkingmoietiesarecoloredinblue;Examplesofthereportergroupsareshownontheright,suchasTAMRAandBiotin化学学报综述ActaChim.Sinica2015,73,657—668©2015ShanghaiInstituteofOrganicChemistry,ChineseAcademyofSciences交反应基团(例如炔基和叠氮基)所取代,在探针标记完成后,再