SETD2通过整合EZH2和AMPK信号通路来限制前列腺癌的转移

SETD2通过整合EZH2和AMPK信号通路来限制前列腺癌的转移导读前列腺癌（PCa）仍然是全世界男性癌症死亡的主要原因。局部肿瘤患者预后良好，而转移患者5年生存期下降至30%。晚期PCa的标准治疗包括雄激素剥夺疗法，该方法能在最初抑制肿瘤，但是在去雄难治性前列腺癌(CRPC)中复发。基因组和转录组学分析的顶点发现致癌基因和肿瘤抑制基因的改变，例如AR、PTEN、TP53以及RB1，以及异常活化的关键信号通路是PCa转移的驱动因子。组蛋白甲基转移酶（HMTs）和去甲基化酶导致PCa转移。HMTEZH2能够修饰抑制性的H3K27me3，使细胞获得侵袭性的特征。研究者发现H3K36组蛋白二甲基化转移酶WHSC1能够与Pten协同作用驱动PCa的转移。在哺乳动物中，SETD2是催化H3K36me3的主要甲基转移酶。SETD2介导的H3K36me3的水平与EZH2催化的H3K27me3的水平成反比。然而，尚不清楚这两种酶活性是否在分子上有关联。在本研究中研究者发现SETD2通过其底物EZH2延迟前列腺癌（PCa）转移，SETD2甲基化EZH2，从而促进EZH2降解。SETD2缺失会引起Polycomb抑制的染色质状态，进而使细胞能够获得转移性状。相反，携带无法甲基化的EZH2突变体或者与EZH2结合缺陷的SETD2突变体的小鼠会产生转移性PCa。此外，研究人员发现二甲双胍刺激的AMPK信号会影响FOXO3来刺激SETD2表达。总之，这些结果表明SETD2-EZH2信号轴整合了代谢和表观遗传信号，进而限制PCa的转移。实验设计结果1SETD2对PCa具有重要的临床和功能意义为了确定SETD2在PCa中的重要性，研究者比较了代表惰性肿瘤Pten-/-小鼠和转移PCa的Pten-/-;Trp53-/-小鼠前列腺裂解液中H3K36me3/SETD2以及H3K27me3/EZH2的水平，结果发现H3K27me3和EZH2的水平与小鼠肿瘤进展正相关，并且在转移肿瘤中的表达水平高于惰性肿瘤（图1A）。重要的是，SETD2/H3K36me3以及EZH2/H3K27me3在小鼠前列腺组织中是互斥的（图1A）。因此研究者致力于确定PCa中SETD2的临床相关性。qRT-PCR的实验证实SETD2在前列腺肿瘤中的表达降低。公共数据集分析发现SETD2在CRPC和NEPC中的表达进一步降低，侵袭性的PCa亚型倾向于转移。此外，研究者发现SETD2mRNA水平与疾病复发负相关。为了拓展这一结果，研究者利用SETD2抗体在肿瘤组织芯片上进行了IHC染色，如图1B，SETD2低表达的患者具有更短的无复发生存期。具有较高格林森分数（GS）的患者SETD2的表达降低（图1C）。多变量分析也发现SETD2负载预后价值，不依赖于前列腺特异的抗原水平和GS值。总之，这些结果表明SETD2在限制PCa进程中的作用。研究者接下来进行了类器官实验以确定SETD2的功能是否是细胞自发的方式。研究者从2个月大Pten-/-小鼠中分离得到管腔细胞，并且在Pten缺失类器官中利用病毒稳转的shRNA敲除SETD2。结果发现Setd2沉默提高了类器官形成的能力（图1D、E）。在Setd2不足的类器官中Ki67+增殖细胞，而不是CD8+管腔细胞或者P63+基底细胞，频率升高（图1F）。由于SETD2的表达在转移肿瘤中下调，研究者通过dCas9-GCN4-调节的CRISPR活化在Pten-/-;Trp53-/-类器官中过表达SETD2（图1G）。结果发现SETD2的表达使这一致死亚型类器官的形成受损（图1H）。这些结果表明SETD2在PCa中非常重要。图1.SETD2对PCa具有重要的临床和功能意义。（A）对小鼠前列腺裂解液中指定蛋白进行免疫印迹分析；（B）基于TMA中SETD2的表达进行IHC染色和Kaplan-Meier复发分析；（C）在TMA中依据GS值对SETD2的IHC分值分类；（D）对两个月大Pten-/-小鼠前列腺产生类器官中的SETD2进行IB分析；（E）对类器官形成的效率和到校进行成像和定量；（F）对特定部位进行免疫染色；（G）在两个月大Pten-/-;Trp53-/-类器官中过表达SETD2进行IB分析。（H）两个月大Pten-/-;Trp53-/-类器官中过表达SETD2进行类器官形成效率和大小的成像和定量分析；2Setd2与Pten协同缺失导致PCa转移为了证实Setd2在体内的功能，Setd2floxed/floxed小鼠与前列腺上皮Probasin-CreSetd2的小鼠交配。病理组织分析发现Setd2-/-动物畸形生长或者多灶性低级别前列腺瘤变(LGPIN)。Setd2-/-小鼠源系PIN病变呈筛状和/或管状结构组织。然而，在接下来的16个月，研究者并未检测到腺瘤的发展，表明只有Setd2缺失不足以驱动PCa。因此研究者将Setd2-/-小鼠与Ptenfloxed/floxed小鼠交配产生Pten+/-;Setd2-/-小鼠。所有Pten+/-;Setd2-/-小鼠15个月大部分死于膀胱出口梗阻（肾水肿），而Pten+/-小鼠存活超过20个月（图2A）。MRI成像发现相较于对照组，在8-至10-个月大的Pten+/-;Setd2-/-小鼠中平均前列腺肿瘤的体积大约5-至8-倍升高（图2B）。与8-10个月发展中LGPIN的Pten+/-小鼠相反，Setd2缺失导致高度前列腺上皮内瘤变的进展加快，在5-6月开始，8-10月发展为转移性肿瘤（图2C-E）。相应的，Ki67染色的增加表明Setd2缺失赋予了细胞增殖的优势。重要的是，Setd2缺失小鼠肿瘤周边平滑肌鞘明显受损，表明肿瘤发展为转移性的PCa（图2D）。因此，管腔来源的前列腺肿瘤细胞侵袭至基底。与此对应的，Setd2缺失的PCa在AR-或者CK8-阳性肿瘤结节中表现出广泛的转移范围，包括腰椎淋巴结、肺、肾脏、肝脏等（图2E）。此外，在8个月大Pten+/-;Setd2-/-小鼠外周血和远端器官也检测到Cre敲除的Pten或者Setd2重组等位基因，表明转移肿瘤的前列腺起源以及血管扩散（图2F）。总之，Setd2失活以及Pten缺失促进了PCa转移。图2.Setd2与Pten协同缺失导致PCa转移。（A）Kaplan-Meier对Pten+/-以及Pten+/-;Setd2-/-小鼠的生存期进行分析；（B）MRI分析如图所示，定量的数据在右侧显示（n=6）；（C）对组织学分级进行定量（n=10），**p0.01；（D）对特定时间前列腺SMAa进行H&E染色和IHC染色；（E）对8-10个月大Pten+/-;Setd2-/-小鼠组织进行H&E以及AR、CK8染色；（F）在特定组织中检测Cre敲除的Pten以及Setd2重组。3Setd2缺失诱导的PCa转移依赖于EZH2活性升高为了探究Setd2缺失如何提高转移的特征，研究者对三个月大Pten+/-以及Pten+/-;Setd2-/-小鼠来源的类器官进行了转录组学分析，来鉴定早期的驱动事件。Setd2缺失导致492个基因受到抑制，且299个基因产生（图3A）。信号通路和基因集富集分析表明所有差异表达的基因在EZH2和H3K27me3信号显著富集。qRT-PCR分析也证实了Setd2缺失的类器官细胞中EZH2直接抑制靶基因的表达的确降低（图3B）。有趣的是，对小鼠前列腺和PCa细胞分析发现Setd2缺失导致EZH2和H3K27me3水平的升高，但是不影响EZH2mRNA水平（图3C）。EZH2表达的升高在Setd2缺失小鼠正常前列腺管腔细胞中也检测到（图3C）。同样，研究者发现C4-2细胞中SETD2敲除（KD）能够显著稳定EZH2（图3D）。为了证实这一发现，研究者利用ChIP-seq分析了H3K27me3。在Setd2缺失的类器官细胞中检测到H3K27me3的信号升高（图3E）。图3F中基因组也说明在Setd2缺失细胞中EZH2靶基因Cdkn2a、Sox7的转录抑制伴随H3K27me3的水平升高。总之，这些结果表明SETD2缺失导致PCa细胞Polycomb抑制的染色质状态。研究者猜想这些结果是否具有临床相关性。对免疫印迹结果定量发现高GS患者中H3K36me3vsH3K27me3、SETD2vsEZH2之间负相关。考虑到在转移性CRPC中EZH2的表达最高并且与神经内分泌亚型相关，研究者进一步分析发现在CRPC和NEPC患者中SETD2的表达与EZH2的特征负相关。研究者也进行了免疫染色实验对晚期PCa中的SETD2和EZH2进行描述，包括高GS的腺瘤、CRPC以及NEPC，结果发现这两个蛋白之间的负相关（图3G）。这些结果说明在PCa中存在敌对的表观机制剥夺EZH2。为了确定Setd2缺失是否会通过EZH2上调促进前列腺癌的发生发展，研究者在Pten+/-类器官中敲除Setd2的同时敲除了EZH2。与之前的报道一致，Ezh2缺失并没有导致可识别的缺陷，可能是由于Pten+/-小鼠中EZH2水平很低。相反，在Pten+/-;Setd2-/-类器官中敲除Ezh2使Setd2缺失引起的过量生长受到削弱。EZH2最主要的功能是作为PRC2复合体的酶促亚单元催化H3K27me3。利用EED的变构抑制剂EED226或者EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126处理导致Setd2不足类器官的生长减弱，同时伴随H3K27me3水平降低。研究者将Ezh2-floxed小鼠与Pten+/-;Setd2-/-小鼠交配。尽管在Pten+/-;Ezh2-/-以及Pten+/-小鼠前列腺组织中没有显著差异，Pten+/-;Setd2-/-小鼠中Ezh2缺失减弱了前列腺癌的进展（图3H、3I）。重要的是，研究者整合RNA-seq数据发现Pten+/-;Setd2-/-细胞中Ezh2缺失导致超过半数SETD2调节的基因(441/791)恢复表达至Pten+/-类器官的水平（图3J）。总之，这些结果表明Setd2缺失以EZH2依赖的方式加速了前列腺癌的发生发展。接下来研究者探究了Setd2不足细胞中EZH2聚集如何驱动促癌的机制。研究者将基因表达数据与H3K27me3ChIP-seq数据整合，以探究EZH2直接调控的靶基因。在Setd2缺失基础上有128个基因下调并且获得H3K27me3，通过Ezh2KO补救，研究者将其命名为依赖EZH2的SETD2特征。研究者证实在Pten+/-;Setd2-/-Ezh2细胞中缺失确实能够减弱代表性基因的降低。研究者选取了10个基因(Cdkn2a,Dab2ip,Epha7,Sox7,Vash1,Adrb2,Ephb6,Fbxo31,Gas1以及Timp4)进一步进行功能分析。结果发现敲除Cdkn2a,Dab2ip,Epha7,Sox7,以及Vash1能够促进Pten无效类器官的生长。Cdkn2a,Dab2ip以及Vash1有助于EZH2促进肿瘤的发生发展。有报道称在其他肿瘤模型中Sox7和Epha7是肿瘤抑制基因。因此这些结果表明Cdkn2a,Dab2ip,Epha7,Sox7以及Vash1可能有助于PCa中SETD2发挥功能。图3.Setd2缺失诱导的PCa转移依赖于EZH2活性升高.（A）小提琴图说明3个月大小鼠指定类器官间差异表达的基因，代表基因如图；（B）热图总结了三个月大小鼠产生的类器官qRT-PCR验证的结果；（C）对6个月大小鼠前列腺中指定蛋白进行IHC分析；（D）CHX处理的对照组或者SETD2KD组中C4-2细胞的IB分析，条形图代表EZH2蛋白的水平，**p0.01.（E）热图分析显示在3个月大小鼠产生的类器官中TSS-2kb~TES+2kb的H3K27me3上13412个基因峰图；（F）在Cdkn2a和Sox7基因位点上H3K27me3的RNA-seq以及ChIP-seq轨迹；（G）热图显示在PCa中SETD2和EZH2之间的IHC值。（H）8个月大小鼠指定前列腺的H&E染色；（I）对组织学等级进行定量（n=8），**