核酸检测技术讲解

第2章核酸检测技术核酸检测技术直接对动植物有害生物基因序列和结构进行测定。核酸的分离纯化PCR技术核酸杂交技术第1节核酸的分离纯化核酸的分离纯化的原则1.保持核酸一级结构的完整性2.提高核酸制品的纯度技术路线的设计破碎细胞的方法机械（匀浆、超声破、研磨等）非机械（化学处理、生化法）沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。优点缺点乙醇对盐类沉淀少，易挥发除去，不影响后续实验需要量大，低温操作异丙醇需体积小，速度快，一般不需低温长时间放置易使盐类、糖类与DNA共沉淀；异丙醇难以挥发除去核酸浓度检测与完整性测定方法浓度测定紫外分光光度法260nm荧光光度法EB荧光完整性测定琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状；完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值问题一：DNA样品不纯抑制后续酶解和PCR反应DNA提取常见问题DNA提取常见问题问题二：DNA降解DNA提取常见问题问题三：DNA提取量少真菌昆虫第2节PCR扩增技术PCR,a‘DNAphotocopier’PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明•1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。•但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……•1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）•最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错•耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪•1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明KaryB.Mullis（1944－）年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。1.PCR的基础PolymeraseChainReactionPCRTheonlyenzymeusedinthisreactionisDNApolymerase.PolymeraseChainReactionTheproductsofthefirstreactionbecomesubstratesofthefollowingone,andsoon.PCRPolymeraseChainReactionPCRComponents：ThermostableDNAPolymerase，TargetDNA，PairofPrimers，dNTPs，Mg++ions，BuffersolutionDenaturation：ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing:Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg2+.ThePCRcycle:ThreedifferentstepsineachPCRcyclePCR的扩增？HowdoesPCRworkThefirstcycleThesecondcycleHowdoesPCRworkThethirdcycleThefourthcycle2.PCR的类型1.多重PCR（multiplexPCR）2.巢式PCR（nestedPCR）3.定量PCR（quantitativePCR）4.不对称PCR（asymmetricPCR）5.反向PCR（inversePCR）6.逆转录PCR（reversetranscriptionPCR）7.OverlapPCR……•PCRusingseveralprimerpairsSIMULTANEOUSLY•Typicallygeneratesaproductbandforeachprimerpair多重PCR（multiplexPCR）:What2.1多重PCR（multiplexPCR）MultiplexPCR:Why•Detectseveralgenesatonce–eg.transgenicplantscreen•Internalcontrols–VERYimportant–TellsyouhowwellthePCRreactionworked–Reduces“falsenegatives”–Reduces“falsepositives”多重PCR（multiplexPCR）MultiplexPCR:How•SameasregularPCR•Careinprimerdesign–Muchgreaterchanceofprimer-dimers–Muchgreaterchanceofartifacts–Annealingtemperaturesmustbeclose多重PCR（multiplexPCR）ATypicalMultiplexPCRReactionSterileWater34.0ul10XPCRBuffer5.0ulMgCl2(50mM)2.5uldNTP’s(10mMeach)1.0ulPrimer1FWD1.0ulPrimer1REV1.0ulPrimer2FWD1.0ulPrimer2REV1.0ulPrimer3FWD1.0ulPrimer3REV1.0ulDNAPolymerase0.5ulDNATemplate1.0ulTotalVolume50.0ul多重PCR（multiplexPCR）MultiplexPCR:Example•Threeprimerpairs–Control,resistance,andtraitgenes•Controlgenefragmentislargestand(almost)faintest•TraitgeneissmallestandbrightestResistanceGeneTraitGeneControlGenePrimers多重PCR（multiplexPCR）MultiplexPCR:Example•ThreeprimerpairsResistanceGeneTraitGeneWhicharetransgenic?ControlGenePrimers多重PCR（multiplexPCR）NestedMultiplexPCR2ndStagePCRDilute100foldBetween1st&2ndstagereactions1F1R2R3R5R6R3F2F6F4F5F4RPrimaryMultiplexRT-PCR多重PCR（multiplexPCR）2.2定量PCR（quantitativePCR）实时荧光定量PCR（RealtimeQuantitativePCR）：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。Real-timePCRmonitorsthefluorescenceemittedduringthereactionasanindicatorofampliconproductionateachPCRcycle(inrealtime)asopposedtotheendpointdetection荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测（1）定量原理三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析荧光定量PCR原理——扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：基线期、指数增长期和平台期。Cycle（循环数）Rn（荧光强度）基线期平台期平台期荧光定量PCR原理——荧光域值Cycle（循环数）Rn（荧光强度）基线期指数扩增期平台期荧光域值手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段荧光定量PCR原理——Ct值PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)value纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性Ct值的重现性定量原理•理想的PCR反应：•X=X0*2n•非理想的PCR反应：•X=X0(1+Ex)n•n：扩增反应的循环次数•X：第n次循环后的产物量•X0：初始模板量•Ex：扩增效率扩增效率E（amplificationefficiency）一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值位于0到1之间。在PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该直线斜率）即可计算出E值。在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)CT=-klgX0+b（线性方程）LogX0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。标准曲线：CT值对[DNA]0作图模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration（2）荧光定量PCR的化学原理1.Hydrolysisprobes（水解探针）(TaqMan,Beacons)2.DNA-binding(intercalating)agents（结合）(SYBRGreen,EvaGreen,LCGreen)3.HybridizationorFRETprobes（杂交）(LightCycler)非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、AmplisensorQQRDNA产物的荧光标记SYBRGreen法SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。信号强度与DNA分子总数目成正比。SYBRGreen5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitationSYBRGreen法优缺点对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA使用方便-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优