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研发部岗前培训牛血清细胞培养技术中文名称：胎牛血清英文名称：fetalcalfserum定义：采自胎牛的血清。含有多种生长因子，常用于体外细胞培养。一、胎牛血清各项质量指标符合2005版《中华人民共和国药典》第三部附录的要求。1、性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。2、蛋白质含量3.5%～5.0%（w/v）3、血红蛋白含量≤0.02%（w/v）4、无菌检验阴性5、支原体检验阴性6、细菌内毒素≤5（EU/ml）7、牛腹泻病毒阴性8、大肠杆菌噬菌体阴性9、支持细胞增殖(Sp2/0-Ag14)生长曲线（接种浓度）最大增殖浓度≥2.5×106个/ml细胞倍增时间≤15h克隆率≥85%血清的主要成分血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。功能牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。2.提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。5.起酸碱度缓冲液作用。6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。胎牛血清与小牛血清不同点1、来源不同：胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS)是在屠宰怀孕母牛的时候,通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清，新生牛(小牛)血清(Calfserum,CS)采自出生10至14天的小牛。组份与比例不同：两者所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组份与比例不同，用途与用法不同：某些细胞必需胎牛血清才能生长，而有些细胞只需小牛血清即可，使用浓度不同，一般在5%-10%，有特殊要求的浓度在20%。血清保存和使用须注意：血清应保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超过一个月。解冻血清时，应先将血清至于2-8℃冰箱，并经常摇匀使之溶解，然后至室温放置使之升温，绝对不可将冷冻的血清直接放入37℃水浴或者温箱中，如放在37℃解冻，颜色加深，粘稠度也会增加，血清在解冻和热灭活后，应按用量分装并于-20℃保存，避免反复冻融。2、胎牛血清，小牛血清和新生牛血清三种之间的区别：这三种血清的成份，总体没有什么明显差别，只是有一些成分与其生存环境有关，如上述有人说的抗体很等少。此外，因生长发育的需要，有些成分在小牛出生后会发生一些变化。不过还没有搞清楚它与其它的血清之间的差别。有一点可以肯定，胎牛血清中的部分功能蛋白与小牛血清中的含量有差别。3、最为重要的一点是：胎牛本身生活在一个洁净环境当中，其血清与外界隔绝，只要生产工艺科学规范，其质量肯定要比后两者好。4、根据牛出生时间和血清采制分离方法分为：（1）胎牛血清：八月龄胎牛心脏穿刺取血;（2）新生牛血清：出生12-24小时新生牛静脉采血;又可细分为：a.高级新生牛血清：采血后静置自然析出的血清;b.标准新生牛血清：c.经离心分离的血清;d.普通新生牛血清：融血或微融血的血清;（3）小牛血清：出生三月龄小牛动脉采血分离血清;血清是血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。一、细胞培养(cellculture)的定义从体内取出细胞，在模拟体内生理环境下（无菌、适当温度和一定的营养条件），使细胞生存、生长并维持其结构和功能的方法。INVITRO:（离体的，即在容器中）用培养细胞进行的实验INVIVO:（在体的）完整机体内进行的实验二、细胞培养的优点与不足（一）优点：1.长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动：细胞学、遗传学、免疫学、肿瘤学……2.摄影、摄电影和闭路电视等方法记录细胞变化3.细胞种类广泛：从低等生物到高等生物（人）；从胚胎到成体；从正常细胞到肿瘤细胞4.便于使用各种技术：相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、组织化学、同位素标记等5.易于使用物理、化学和生物因素等进行研究6.提供大量生物性状相似的实验对象，更经济（二）不足：1.即使模拟体内环境的技术发展很快，但是与体内环境相比，仍有较大差异2.对无菌要求高3.失去神经体液的调节和细胞间的相互作用：去分化、永生或恶变三、培养细胞的形态分类（一）贴附型这类细胞在培养时能贴附在支持物表面生长大多数培养细胞呈贴附型生长只依赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细胞分类：成纤维型细胞（中胚层间充质起源）、上皮型细胞（内、外胚层起源）、游走型细胞（活跃的游走与变形运动）、多形型细胞（神经细胞）（二）悬浮型不贴附在支持物上生长呈悬浮状态生长，胞体为圆形如某些癌细胞和血液白细胞特点：生存空间大，容许长时间生长，能繁殖大量细胞，便于进行细胞代谢等研究（三）细胞冻存与复苏培养细胞在传代过程中性质容易发生变化，且有支原体污染的危险解决方法：细胞冻存，需要时复苏在培养液中加入冷冻保护剂（小分子：甘油、二甲亚砜），以减少细胞内液形成冰晶对细胞的损伤。大分子：蔗糖、卵黄，稳定细胞膜复苏：手工降温、程序降温仪——“慢冻速溶”五、培养细胞的生存环境（一）无污染环境细胞培养环境无毒、无菌是首要条件人体：皮肤、黏膜；免疫系统；解毒器官（肝脏）体外：保持细胞培养环境无任何污染，及时清除代谢物（二）温度人和哺乳动物培养细胞标准温度：36.5°C±0.5°C培养细胞对低温的耐受力比其对高温强≤39°C四、细胞培养的基本技术（一）细胞分离与原代培养原代培养（primaryculture）也称初代培养，指从供体分离得到所需细胞后，接种于培养器皿，进行首次培养培养材料为血液、胸水、腹水和羊水等细胞悬液时，可采用低速离心分离培养材料为组织块时，将组织块剪切得尽可能细小，然后用胶原酶或胰蛋白酶进一步消化，以获得细胞悬液细胞分离与原代培养（二）细胞的传代（secondaryculture）细胞由原培养器皿内分离稀释后传到新的培养器皿的过程为传代贴附细胞的传代：多采用含有胰蛋白酶和EDTA的消化液消化传代，然后以合适比例接种在新的培养器皿内悬浮细胞的传代：可直接添加新鲜培养液，或离心收集后换新鲜培养液，再以一定比例稀释传代细胞系（cellline）：在细胞培养中产生了具有无限增殖能力的变种细胞，这种细胞可被无限的传代常见的细胞系：NIH3T3细胞系：取自小鼠胚胎细胞建立(1963年)Hela细胞系：取自人宫颈癌细胞建立(1952年)贴附型细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期，平顶期）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态。也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形10分钟～4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟～4小时贴壁底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）细胞贴壁过程细胞贴壁过程潜伏期：此时细胞有生长活动，但是无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性细胞的生长过程（三）气体环境与pH值多数细胞生长需要O2，闭合式单层细胞培养氧分压1995-9975Pa开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般将细胞置于95%空气加5%CO2混合气体环境中CO2的主要作用在于维持培养基的pH值，多数细胞的适宜pH值为7.2–7.4原代培养细胞一般对pH的变动耐受差；永生细胞和恶性肿瘤细胞耐受力强总的说来，培养细胞耐酸性比耐碱性大一些（四）体外培养细胞生存所需基本物质六碳糖是主要的能源（葡萄糖、半乳糖）1.糖2.氨基酸所有的细胞都需要谷氨酰胺，其所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；其它还有精氨酸、胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸等培养细胞也需要维生素，如生物素、叶酸、泛酸、核黄素、硫胺素、胭酰胺等3.促生长因子EGF,FGF,NGF,PDGF,EDGF等激素：胰岛素——促进细胞利用葡萄糖和氨基酸氢考——促进上皮细胞生长4.其它物质基本元素：钾、钠、钙、镁、氮和磷微量元素：铁、锌、硒等（五）渗透压人血浆渗透压约290mOsm/kg，可视为培养细胞的理想渗透压鼠细胞渗透压约320mOsm/kg大多数培养细胞的渗透压在260mOsm/kg-320mOsm/kg（六）培养基按物质状态：半固体培养基，液体培养基按其来源：（1）合成培养基：根据已知细胞所需物质的种类和数量严格配制而（2）天然培养基：成分尚未搞清楚，如血清、血浆等（3）无血清培养基：基本培养基＋促生长物质（七）附着底物除少数悬浮型细胞外，绝大多数培养细胞需要合适的底物以附着其上类型：（1）玻璃：透明、易观察、易洗涤、能反复使用；缺点：易破碎（2）一次性塑料：常用聚苯乙烯，聚四氟乙烯；缺点：易产生划痕，不宜反复使用（3）微载体：由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球体，附着面大，利于大量繁殖细胞（4）饲细胞（FeederCells）：也称滋养细胞，如用成纤维细胞长成单层后，大剂量射线照射，细胞失去增殖能力但尚存活并有代谢活动；再将其它细胞接种于其上。饲细胞的代谢产物利于其它细胞生长（八）抑制细胞生长因素制备培养基消毒不彻底：有毒物质或微生物混入细胞生存环境中血清灭活：能除去培养基中的补体和降低免疫球蛋白的毒性，并不损伤多肽生长因子，但可能灭活另一些有用的成分六、细胞培养的设施与基本条件实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒滤器：过滤除菌，大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发纯水仪七、器械用于解剖动物、取材和原代培养切割组织等解剖刀（剪）、镊子、缝针（线）、持针器、止血钳等八、培养器皿（一）玻璃瓶皿玻璃瓶：用于配制、储存培养液、血清等培养瓶：用于培养细胞培养皿：用于培养和分离细胞吸管、离心管、烧瓶（杯）、量筒、漏斗、试管、注射器等（二）