双底物酶促反应动力学机理

第四节酶促反应动力学（一）一、底物浓度对酶反应速度的影响二、米氏公式的导出三、米氏方程的讨论四、米氏常数的求法五、多底物的酶促反应动力学一、底物浓度对酶促反应速度的影响21345678002468底物浓度mmole生成物浓度806040200S+E↓P(固定酶的浓度在固定时间内反应)JuangRH(2004)BCbasics（单底物酶促反应）PSE酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。231KEPKESKSE酶的底物饱合现象——中间络合物学说非酶催化剂酶催化剂中间产物假说证据Michaelis与Menten提出酶催化动力学MichaelisMentenNelson&Cox(2000)LehningerPrinciplesofBiochemistry(3e)p.2581913年][][*maxSKsSVVKs为底物解离常数（底物常数）][][])[]([12ESSESEkkKs231KEPKESKSE二、米氏方程的导出1、根据酶反应的中间复合物学说：假定E+SES迅速建立平衡，底物浓度远远大于酶浓度下，K3K2即K3反应特别慢，可以忽略不计。米式方程的导出：早年的米式方程基于快速平衡假说4231KKEPKESKSE①在反应的初始阶段，[S]远远大于[E]，因此，[S]可以认为不变。②因为研究的是初速度，P的量很小，由P+EES可以忽略不记。231KEPKESKSE③游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而ES形成产物的速度极慢，故，[ES]的动态平衡与ESP+E没有关系（既K1、K2＞＞K3）ES的生成速度：K1（[E]-[ES]）[S]ES的分解速度：K2[ES]K1（[E]-[ES]）[S]=K2[ES]][]][[][121SKKSEKES反应速度：][][][]][[][max1233SKSVSKKSEKESKVSKS现在称为底物常数231KEPKESKSE米氏推导酶促反应速度公式时，认为[ES]的积累是快速平衡的结果，而没有考虑ESE+P这一步。而Briggs认为应当考虑这一步，因为并不总是K3K2,ESE+P这一步也可能速度很快，这时，E，S和ES将不能处于一个平衡状态。布氏提出稳态理论。1925年Briggs和Haldane提出稳态理论ES+P+ES的生成量与消失量相等，故平衡时[ES]浓度成一稳定状态。SEESteadyState时ES的浓度恒定SPEES反应时间浓度JuangRH(2004)BCbasicsBriggs的酶促反应模型:ESESEP++k1k2k3k4布氏提出以下假设:1.反应开始时,P=0,不足已产生逆反应.测定酶的反应速度一般是测定反应的初速度,即产物浓度变化在5%以内的速度.2.ES0即反应中S=.S03.反应开始后,反应立刻进入恒态状态,ES浓度处于稳定状态的形成速度等于其分解速度.ES稳态理论(SteadyStatetheory)的假设稳态理论下米氏方程的推导E+SESE+P(vo)k2k1k3k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]vo=Vmax[S]Km+[S][E0]=[E]+[ES]vo=k3[ES]Vmax=k3[E0]酶必须先与底物结合ES的生成量等于其消失量[ES]浓度恒定SteadyState由上式出发可推得Michaelis-Menten公式JuangRH(2004)BCbasics[E0]酶的总量稳态理论下米氏方程的推导E+SESE+P(vo)k2k1k3推导:的生成速度:的分解速度:ESESddtES=k1ES包括正向:负向:ESESEP+E+Pk2k3ddtES-=k2ES+k3ES当进入稳态时:ddtES=ddtES-即:k1ES=k2ES+k3ES=ESk2+k3S又由酶的恒等式:E0EES=+E=E0-ES则:k1E0-ESS=ESk2+k3整理:E0S-ESS=k2+k3k1ES令:k2+k3k1=km则:E0S-ESS=ESkmE0S=ESkm+SES=E0Skm+Sv=k3ES=k3E0Skm+SVmax=k3E0因:故:v=VmaxSkm+S稳态理论下米氏方程的推导[E0]=[E]+[ES]vo=k3[ES]Vmax=k3[E0][E0]酶的总量当[S]Km时][][][][maxmaxSKKSVSKSVVmm’当[S]Km时当[S]=Km时2][][maxmaxVSKSVVmmaxmaxmax][][][][VSSVSKSVVm米氏方程定量的表达了反应初速度与底物浓度之间的关系与实验结果相符合。三、米氏方程的讨论1.米氏方程的意义①物理意义:当反应速度达到最大反应速度（Vmax)的一半时的底物浓度.②Km的引伸意义:Km是酶学研究中的重要研究数据,表示了酶的一个基本性质.Km值是酶的特征常数之一,与酶的性质有关,而与酶的浓度无关,不同的酶,其Km值不同.对于专一性不强的酶来说对于每一个底物都有一个相应的Km值.2、米式方程中各参数的意义1)Km的意义三、米氏方程的讨论Km与天然底物Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为：Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V对△[S]越灵敏。V[S]1/2VmaxKm三、米氏方程的讨论快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别当K1、K2K3时，即ESP+E是整个反应平衡中极慢的一步SKKKKKKKm12132][][][][maxmaxSKSVSKSVVSm“稳态平衡=快速平衡+慢速平衡”：1312132KKKKKKK当ESP+E极慢（K3/K1极小）时，稳态平衡基本等于快速平衡231KEPKESKSE三、米氏方程的讨论Km、Ks与底物亲和力Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。Ks是底物常数，只反映ES解离趋势（底物亲和力），1/Ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。只有当K1、K2K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与产物形成趋势K3／K1有关）131312132KKKKKKKKKKKsm三、米氏方程的讨论2)Km值的用途——根据Km推测代谢的方向及程度根据正逆反应Km的差别及细胞内正逆两相底物的浓度推测酶促反应的正逆方向。根据代谢途径中各个酶的Km及其相应底物浓度判断限速步骤（Km最大的步骤不一定是限速步骤）根据Km值的大小判断分支代谢的流向酶工程与代谢工程中改造酶的Km调控代谢途径（强化则降低Km，弱化则提升Km）三、米氏方程的讨论3)米式方程的用途（1）根据[S]求V（2）根据V（或相对速度a）求[S]三、米氏方程的讨论设定达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9[S]0.9=9Km同理有：[S]0.8=4Km[S]0.7=2.33Km[S]0.6=1.5Km[S]0.5=1Km[S]0.1=1/9Km[S]0.9/[S]0.1=81[S]0.7/[S]0.1=21三、米氏方程的讨论（3）根据相对速度推测酶活性中心饱和度当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据。当v=1/2Vmax时，表示活性部位有一半被占据。3)米式方程的用途4)、Vmax与K3（Kcat）的意义Vmax不是一个常数，它取决于酶的浓度，它是一个酶反应体系的速度的极限值。Vmax=K3[E0]K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat），表明酶的最大催化效率三、米氏方程的讨论5)、Kcat/Km表示酶的实际催化效率三、米氏方程的讨论在生理条件下，大多数酶并不被底物所饱和，在体内[S]/Km的比值通常介于0.01到1之间][][][][][maxSKmSEKcatSKmSVv[S]Km时：][][SEKmKcatv13213kkkkkKKmcatKcat/Km的上限是K1，既生成ES复合物的速度(酶促反应的速度不会超过ES的形成速度K1，在水相中不会超过108~109）只有Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率1、Lineweaver-Burk双倒数作图法maxmax1][11VSVKVm][][maxSKSVVm四、米氏常数的求法选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量[S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时1/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。[S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时，1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。该作图的缺点是：实验点过分集中在直线的左下方，而低浓度S的实验点又因倒数后误差较大，往往偏离直线较远。从而影响Km和Vmax的准确测定。四、米氏常数的求法2、Eadie-HofsteeV—V/[S]作图法3、Hanes-Woolf作图法4、Eisenthal作图法5、Hill作图法mLogKSLognVVVLog][maxmLogKSLognYYLog][1（寡聚酶）-LogKmLog[S]）（VVVLogYYLogmax1四、米氏常数的求法（一）双底物酶促反应动力学机理序列反应或单一置换反应:有序反应Orderedreaction(orderedBiBi)随机反应Randomreactions(randomBiBi)乒乓反应或双置换反应五、多底物的酶促反应动力学QPBA酶1、有序反应机理只有先导底物A(Leadingsubstrate)首先与酶结合，然后B才能与酶结合，形成的三元复合物EAB（ternarycomplex)转变为EPQ，B的产物P先释放，A的产物Q后释放。●在缺少A时，B不能与E结合五、多底物的酶促反应动力学E→AE→AEB→QEP→QE→EABPQ反应的总方向决定于A、Q的浓度和反应的平衡常数NAD与NADH相互竞争E上的NAD结合部位2、随机反应机理底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合物AEB→QEP，产物P、Q的释放顺序也是随机的。五、多底物的酶促反应动力学限速步骤是AEB→QEPA与Q相互竞争E上的底物结合部位A，B与P相互竞争E上的底物结合部位B反应的总方向决定于A、B、Q、P的浓度和反应的平衡常数3、乒乓反应机理五、多底物的酶促反应动力学整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式谷氨酸：草酰乙酸氨基转移酶符合双置换、双底物机制的酶（二）双底物反应的动力学方程1、乒乓机制的动力学方程][][][][][][maxBAAKBKBAVVBmAmmaxmaxmax1][1][11VBVKAVKVBmAmKmA：[B]达到饱和浓度时A的米氏常数KmA’：A的表观米氏常数Vmax：[A][B]都达到饱和浓度时的最大反应速度五、多底物的酶促反应动力学2、序列机制的底物动力学方程BmAsmaxKK]][[][][]][[BAAKBKBAVVBmAm][][11][1][11maxmaxmaxmaxBAVKKVBVKAVKVBmABmAms五、多底物的酶促反应动力学六、pH值对酶反应速度的影响七、温度对酶促反应速度的影响八、酶浓度对反应速度的影响九、激活剂对酶活性的影响十、抑制剂对酶活性的影响第四节酶促反应动力学（二）大多数酶的活性受pH影响显著，在某一pH下表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。酶表现最大活力的pH