20第20章自动化仪器分析

第二十章免疫检验自动化仪器分析第一节自动化免疫浊度分析系统一、免疫透射比浊法二、免疫胶乳比浊法三、免疫散射比浊法四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用第四节自动化酶联免疫分析系统第二节自动化发光免疫分析系统一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪二、酶联发光免疫分析仪三、电化学发光免疫分析仪四、在临床免疫检测中的应用第三节自动化荧光免疫分析系统一、时间分辨荧光免疫分析仪二、荧光偏振免疫分析仪思考题小结免疫检验自动化（automationofimmunoassays)是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化进行。第一节自动化免疫浊度分析系统免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（19S），在增浊剂（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（19S），使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈函数关系。与已知浓度的抗原标准品比较，可确定标本中抗原含量。一、免疫透射比浊法（一）原理：1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。（二）仪器工作过程2.将待测标本和标准抗原溶液（5个浓度抗原标准品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。（三）方法评价优点:灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确不足:①抗体用量较大；②溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大③透射比浊测定在抗原－抗体反应的第二阶段，检测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2μm），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。二、免疫胶乳比浊法（一）原理：（二）方法评价本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平，操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子(RF)可与IgGFc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab′)2片段代替IgG既可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关，其公式如下：三、免疫散射比浊法(一)原理式Iθ中为与入射光成θ角处散射光强度；λ和I0为入射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；c为浓度；N为阿佛加德指数；γ为颗粒到检测器的距离；θ为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应7.5s～2min内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。(二)定时散射比浊法（fixedtimenephelometry）1.仪器测定技术要点(1)抗原抗体预反应阶段(2)反应阶段(3)信号检测2.抗原过量检测(1)抗体适当过量(2)对抗原过量进行阈值限定定时散射比浊法测定原理示意图BNProSpec全自动特定蛋白分析仪速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1～2min即可完成。(三)速率散射比浊法（ratenephelometry）仪器测定技术要点•开启机器，进行定标•反应阶段•抗原过量检测抗原抗体复合物形成的速率累计时间（s）形成IC总量速率累计时间（s）形成IC总量速率58－1013515251220603525150903023080353007040360604541555504504555480306050020抗原抗体反应速率的动态变化IMMAGE全自动特定蛋白分析仪(三)方法评价散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵,对抗体的质量要求很高。1.抗原抗体比例2.抗体的质量3.增浊剂的使用（一）免疫比浊分析的影响因素四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用4.伪浊度5.入射光光源和波长6.结果报告中的计量单位7.标准曲线制备与质量控制（二）临床应用免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ链、λ链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。第二节自动化学发光免疫分析系统自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂盘(盒)、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组成。吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小的顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结合法等相同。一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪Y顺磁性微粒示意图磁微粒技术磁微粒在电磁场中分离磁微粒标记抗体发光磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体冲洗后双抗体夹心法直接化学发光的机理（1）加入酸性H2O2（pH10）（2）加入碱（pH10）仪器测定技术要点•抗原抗体结合•洗涤、分离•加入氧化剂发光•信号检测吖啶酯标记化学发光免疫测定示意图ACS：180SE和ACS∶CENTAUR化学发光免疫分析仪ACS：180SEACS∶CENTAURci8200i2000sr酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物(发光剂)，由酶催化和分解底物发光，通过光信号的强弱来进行被测物的定量。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶(ALP)，常用的发光底物有鲁米诺、AMPPD和4-MUP等。二、酶联发光免疫分析仪该仪器采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗原或抗体、以塑料锥形小管为固相载体，鲁米诺为化学发光剂，还利用增强剂使化学发光强度增加、时间延长。㈠辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪鲁米诺是一种还原剂，在碱性溶液中被H2O2氧化产生鲁米诺衍生物（激发态）。它以光量子辐射形式返回基态时，发出微绿色可见光。鲁米诺增强化学发光的原理辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫测定示意图VitrosECi全自动增强化学发光酶免分析仪㈡碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪该仪器是以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以顺磁性微粒子为固相载体，用AMPPD作为化学发光剂进行测定的自动化仪器。AMPPD发光反应原理示意图•抗原抗体结合•洗涤、分离•加入AMPPD发光剂•信号检测仪器测定技术要点碱性磷酸酶标记的化学发光免疫测定示意图Access全自动酶标记化学发光免疫分析仪UniCel™DxI800IMMULITE2000型全自动酶标记化学发光免疫分析系统（三）碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪该仪器以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以塑料微粒为固相载体包被抗体（或抗原），以4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）作为酶促反应的荧光基质（底物），底物被酶水解后，脱磷酸根基团，形成4-甲基伞型酮(4-MU)，用360nm激发光照射，发出450nm的荧光。4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）反应原理示意图仪器测定技术要点•抗原抗体结合•洗涤、分离•加入底物4-MUP•信号检测碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫测定示意图AXSYM全自动酶标记荧光免疫分析仪AIA-1800型全自动酶标记荧光免疫分析仪电化学发光免疫分析（ECLIA）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术，生物素放大技术，以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钌标记抗原或抗体，三丙胺(TPA)为电子供体，而设计的一种自动化分析仪器。电化学发光稳定、持续时间长，易于控制并可根据待测分子的大小设计成多种反应模式如夹心法、竞争法等。三、电化学发光免疫分析仪三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+分子结构图电化学发光剂发光的反应原理磁性微粒直径2.8µm，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微粒体积小，悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相，在磁场中易于分离。仪器测定技术要点•抗原抗体结合•电化学发光反应•光信号检测•检测完毕电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定工作示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图ELECSYS2010型全自动电化学发光免疫分析仪ModularAnalyticsE模块170型可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测，是目前免疫化学应用最为广泛的新技术。四、在临床免疫检测中的应用第三节自动化荧光免疫分析系统荧光免疫自动化分析主要是将抗原—抗体结合反应与荧光物质发光分析和计算机技术有机结合的一项自动化免疫分析技术。根据抗原抗体反应后是否需要进行固相分离，分为均相和非均相两类。非均相荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定法；均相荧光免疫测定主要有荧光偏振免疫测定法。时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay,TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物，并与时间分辨测定技术相结合，建立起来的一种新型非放射性微量分析技术，具有灵敏度高，镧系元素发光稳定，荧光寿命长，不受样品自然荧光干扰，标准曲线范围宽等特点，已在临床实验室广泛使用。一、时间分辨荧光免疫分析仪Eu3+元素激发光谱和发射光谱之间的stokes位移（一）、原理时间分辨Eu3+元素荧光信号测量示意图（二）仪器测定技术要点⒈抗原抗体结合⒉加入Eu3+螯合抗体⒊加入酸性增强液4.信号检测固相双抗体夹心TRFIA检测过程示意图增强液(enhancementsolution)，使Eu3+抗体－抗原复合物的PH值降低至2~3，以利于Eu3+从复合物上完全解离下来，游离的Eu3+为增强液中的另一种螯合剂所螯合，在协同剂等其它成分的作用下，与增强液中的β-二酮体生成一个Eu3+在其内部的保护性胶态分子团，这是一个新的具有高强度荧光的稳定螯合物，它在紫外光的激发下发射很强的荧光，信号的增强效果可达上万倍，该技术使用了解离增强步骤，并且采用了前后两种不同的螯合剂，前一种用于Eu3+与抗体标记，后一种用于与解离下来的Eu3+螯合成新的强荧光发射分子，因此，又将该技术称为解离增强镧系元素荧光免疫(dissociation-enhancedlanthanidefluoroimmunoassay,DELFIA)（三）