中药分子检测解决方案

中药材分子鉴定及耶拿高效解决方案介绍QualityistheDifference!主要内容中药材分子检方法介绍目标客户及客户工作中的主要困难耶拿公司的相关高效整体解决方案中药分子检测对AJ销售的重要意义2中药材分子鉴定方法介绍中药材鉴定的主要内容鉴定目的：保证用药的安全性和有效性4鉴定内容真伪鉴定纯度鉴定品质优良度鉴定中药材：包括药材、药材粉末、部分药材饮片中药材鉴定的主要内容鉴定目的：保证用药的安全性和有效性5鉴定内容真伪鉴定纯度鉴定品质优良度鉴定重点、难点四大传统经典的鉴定方法一、原植物（原动物）基原鉴定：是中药基原鉴定的基础，观察其形态特征，应用植（动）物分类学的知识进行鉴定局限性：直接用于中药材及其饮片的鉴别有一定难度，因为形态易有较大变化6四大传统经典的鉴定方法二、性状鉴定：利用人体的感觉器官（眼观、手摸、鼻闻、口尝、水试、火试等）去观察性状，进行鉴定局限性：可以确定部分中药的基原品种，但难以区别开大部分来自近缘物种的中药材和中药饮片7四大传统经典的鉴定方法三、显微鉴定：利用显微镜对药材或成方制剂的组织、细胞或内含物进行鉴别局限性：可以确定部分中药的基原品种，但难以区别开大部分来自近缘物种的中药材和中药饮片8四大传统经典的鉴定方法四、理化鉴定：利用物理或化学的方法对药材和制剂进行定性和定量的分析（色谱、紫外、红外、质谱、核磁共振等）局限性：因中药活性成分的含量受到其生长条件、采收时间、贮藏等因素的影响而发生变化，容易影响鉴定结果的准确性，同时亲缘关系较近的物种化学成分相似而难以区分9中药材的分子鉴定法应运而生正如法医领域的犯罪嫌疑人鉴定、亲子鉴定等，采用的就是基于DNA的分子鉴定法A、T、G、C四种核苷酸组成的基因序列每个人种都有自己特定的基因每个人都有自己特定的基因利用DNA分子鉴定的方法，可以最准确、最科学地得到真伪鉴定结果10中国药典在中药材分子鉴定相关内容的发展2010版《中国药典》收载了乌梢蛇饮片、蕲蛇饮片、川贝母药材的DNA分子鉴定方法2015版《中国药典》收载了“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”，标志着中药材的分子鉴定从实验室科研层面进入国家标准的应用层面11中药材分子鉴定方法——聚合酶链式反应法（PCR法）取样及样品处理DNA提取PCR扩增电泳分离凝胶成像判定结果12第一步第二步第三步核酸质控以2015中国药典中的乌梢蛇饮片为例：13聚合酶链式反应法——PCR第一步：DNA提取以2015中国药典中的乌梢蛇饮片为例：14聚合酶链式反应法PCR：在体外将某一DNA片段（目的基因）扩增，以获得大量的目的DNA片段1—2—4—8—16—32—64—128--------2n指数扩增一般PCR反应运行30个循环，即可得到几百万条目的DNA片段第二步：PCR反应以2015中国药典中的乌梢蛇饮片为例：15聚合酶链式反应法第三步：电泳检测（含电泳分离和凝胶成像条带分析）结论：样品是乌梢蛇川贝母蕲蛇162015中国药典中另一种分子鉴定方法：中药材DNA条形码分子鉴定由中国中医科学院中药研究所所长陈士林院士为主开发制定主要的核心也是PCR方法，区别：下游改用测序的方法，比对数据库序列来鉴定17取样及样品处理DNA提取PCR扩增电泳分离凝胶成像回收片段测序数据库序列比对得到鉴定结果测序鉴定中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则介绍中药材DNA条形码分子鉴定法，就是通过分子生物学的方法测定中药材基因组上一段标准的、具有足够变异的特有的DNA序列，来实现物种鉴定。指导原则中，以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材的方法体系植物类中药材选用ITS2为主体序列，psbA-trnH为辅助序列动物类中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列ITS2：核糖体DNA中内部转录间隔区2psbA-trnH：叶绿体上去除psbA基因及trnH基因的基因间隔区序列COI：线粒体上细胞色素C氧化酶辅酶I以上基因片段通常是几百bp，都具有多态性，常用于物种鉴定18核心：PCR法实验设计：ITS2片段扩增：正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。psbA-trnH片段扩增正向引物：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；反向引物：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。COI序列扩增正向引物HCO2198：5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；反向引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′。19PCR反应体系配置：PCR反应体系以25μL为参照：PCRBuffer（10×）2.5μLMgCl22μL（25mmol/L）dNTPs混合物2μL（2.5mmol/L）上游和下游引物各1.0μL（2.5μmol/L）TaqDNA聚合酶1.0U模板DNA1μL加无菌双蒸水至25μL应设置未加模板DNA的阴性对照。20PCR反应程序：ITS2序列扩增程序：94℃，变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环；72℃延伸10min。psbA-trnH序列扩增程序：94℃变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸7min。COI序列扩增程序：94℃1min；94℃1min，45℃1.5min，72℃1.5min，5个循环；94℃1min，50℃1.5min，72℃1min，35个循环；72℃5min。21测序后结果分析将获得的序列应用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）方法进行结果判定，可以在中药材DNA条形码鉴定系统或GenBank数据库中进行BLAST鉴定中药材DNA条形码鉴定系统GenBank数据库BLAST鉴定产物电泳回收扩增片段进行测序以及序列拼接中药材DNA条形码鉴定系统23中药材DNA条形码鉴定数据库中药材DNA条形码鉴定数据库涵盖了中国药典、韩国药典、日本药局方、印度药典、欧洲药典和美国药典几乎所有的中草药药材中草药DNA条形码鉴定数据库每6个月更新一次数据库具有提交数据功能，研究人员可以提交可靠的DNA条形码序列，经审核后提交的DNA条形码序列将被纳入中药材DNA条形码数据库，供世界范围的研究者使用24中药材DNA条形码分子鉴定法方法流程26样品采集DNA提取PCR扩增电泳凝胶成像条带测序试剂盒CTAB法序列拼接数据分析胶回收物种鉴定DNA质控核心：核酸提取PCR法测序《中药分子鉴定通则》团体标准正式发布2016年12月12日，中华中医药学会批准《中药分子鉴定通则(T/CACM010-2016)》标准，并予以公告由中国中医科学院中药资源中心、中国食品药品检定研究院、国药种业有限公司起草适用于对主要中药材、中药饮片、中药提取物、中成药、中药材种子种苗生产基地、加工、经营等场所开展的抽样检验活动中，需要对其进行真实性验证或身份鉴定的，允许采用DNA分子检测方法分为三个部分，即第1部分：中药材与中药饮片、第2部分：中药提取物与中成药、第3部分：中药材种子种苗27中草药参考基因库计划2017年3月，Illumina与中国医学科学院药用植物研究所（IMPLAD）签署协议，开展千种药用植物基因组计划（1KMPG），共同创建世界首个药用植物参考基因库。分两个阶段，第一批500种药用植物，第二批500种药用植物，共计1000种主要测叶绿体基因组序列利用行业领先技术促进药用植物基因测序与精准鉴定，确保中医产品的质量、安全和有效性，为中医药全面步入国际市场奠定坚实的基础28关注单位各地食品药品监督管理局各地食品药品检验检测中心/所当地药企（希望在行业内建立更先进更高的标准）一些跟中药相关的科研单位29目标客户群及销售机会各地食品药品检测中心国家强制执行中药材分子检测，各地中药材分子检测平台建设各种中药材分子鉴定方法的开发规模较大的中药材生产企业国家强制执行中药材分子检测，中药材分子检测平台建设各种中药材分子鉴定方法的开发中药相关的科研单位各种中药材分子鉴定方法的开发Dummytext30客户现实情况国家强制执行2015年药典中药分子检测方法负责人非生物专业具体操作人员不专业如何建立PCR实验室不清楚试验问题解决没概念耶拿公司优势整体解决方案，全套产品线专业的技术支持完善的售后服务33样品处理核酸纯化核酸定量体系构建核酸扩增电泳检测成像分析德国耶拿的解决方案SpeedMillPlus快速匀浆器——高效中药材破碎高效：采用独特的微珠垂直冲击破碎法，可进行高效、完全的细胞破碎快速：可同时处理20个样品，几十秒至几分钟即可完成方便：样品管支架可预先放在-80℃等低温环境中预冷，进一步保证破碎时样品温度的有效致冷，无需额外的液氮、干冰等制冷剂应用广泛：可处理的样品种类广泛，如各类中药材、动物组织（内脏、干质样品、昆虫、软骨组织等）、植物组织（叶、茎、根、花、果实、种子等）、各类真菌等34InnuPureC16自动核酸纯化仪——全自动中药材DNA提取产物无磁珠残留：无需离心即可直接应用于下游工作无污染：即用型试剂密封预装，tip自动穿刺取样，避免外源污染及交叉污染，紫外灯可有效清洁仪器内部方便：不用加液，不用离心，不用操作电脑软件，不用编程，只需加入样品，选择程序，仪器自动完成提取工作。免费提供核酸纯化程序并终身免费升级灵活：最快40分钟处理1-16个样品35DNA提取试剂盒——有效解决中药材DNA难提取的问题耶拿公司拥有专利性的最新核酸纯化技术DualChemistryTechnology(DC-Technology,双缓冲液技术)，与传统的高离子强度离液盐试剂盒相比，有以下优点：提供了更为温和稳定的裂解环境，提高核酸提取的得率提供了更为温和的生存环境，提高核酸产物的完整性和活性低盐浓度缓冲液体系可以有效减少清洗步骤，提高核酸纯度得到的核酸产物对下游应用无抑制作用，可以长久储存36植物DNA提取试剂盒：含有三种不同的裂解缓冲液，特别适用于成分复杂、DNA难以提取的中药材样品德国耶拿的innuPREPPlantDNAKit独特点：提供三种裂解缓冲液SLS,OPT,CBV，有效应对中药材复杂样品371、石斛--SLS2、南柴胡---SLS3、南柴胡---OPT4、北柴胡---SLS5、北柴胡----OPT6、石斛—OPT结论：石斛用OPT提取效果好柴胡用SLS提取效果好唯一专利性的DC-Technology双缓冲液技术提取石斛和柴胡DNAScanDrop超微量核酸蛋白测定仪——对提取的DNA质量进行把关多功能：是常量、微量、超微量的完美结合，具有三种检测模式，满足各种需求超微量：最低样品量仅需0.3µl高通量：能用两种检测光程连续检测16个样品结果准确稳定：检测光程固定，独有的双光束光路系统，密闭的检测环境，确保检测结果的高度准确性和重复性快速：仪器即开即用，多个样品自动连续检测，操作简便38BiometraTAdvanced基因扩增仪——高效的基因扩增快速：镀金纯银样品槽，实现高效传热效果和快速的升降温速率，最快升温速度可达到8℃/s精准的温度控制：优异的温度准确性0.1℃/s，均一性0.15℃/s线性温度梯度：实现准确的温度梯度设置和控制，方便退火温度的优化静音技术：运行时非常安静，无噪声，提供舒适的工作环境仪器自检功能：可进行自动的检测诊断，确保仪器运行正常舒适：超大的7英寸彩色触摸屏，高清显示，操作直观方便结识耐用：久经考验的德国品质，30