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化学药物有关物质HPLC分析方法验证一、目的了解与规范有关物质方法学验证。二、验证内容1、专属性2、检测限、定量限、3、线性范围4、响应因子5、精密度(重复性、中间精密度和重现性)6、准确度7、耐用性指有其他成分（合成中间体杂质、降解物、副产物等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。1、专属性1、专属性试验方法•空白溶剂•系统适用性溶液5针•中间体及样品•中间体与样品混合溶液•破坏性试验（酸、碱、氧、高温、光照等，用到不同溶剂的，溶剂也要进样对照）•系统适用性溶液1针•图谱打印：•中间体与样品混合溶液、破坏性试验中主成分与主要杂质要打印出光谱纯度和分离度数据，如short+spectum格式打印。•系统适用必至少有一针用extendperformance格式打印。•必要时提供3D图1、专属性峰纯度结果峰名称纯度阈值结果峰名称保留时间RT相对保留时间RRT评价：1、各峰之间的分离状况。2、各峰的峰纯度情况。报告数据：(1)检测限(LOD)检测限系指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。2、灵敏度LOD试验方法•空白溶剂•系统适用性溶液5针•杂质对照品溶液进1针•根据上一针杂质对照品的S/N值进行稀释进样•直到S/N为约3时，平行进样3针。•系统适用性溶液1针•图谱打印：•杂质对照溶液及其稀释液均要以performance+noise格式打印。系统适用必至少有一针用extendperformance格式打印2、灵敏度(2)定量限(LOQ)指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。2、灵敏度LOQ试验方法•空白溶剂•系统适用性溶液5针•杂质对照品溶液进1针•根据上一针杂质对照品的S/N值进行稀释进样•直到S/N为约10时，平行进样3针。•系统适用性溶液1针•图谱打印：•杂质对照溶液及其稀释液均要以performance+noise格式打印。系统适用必至少有一针用extendperformance格式打印2、灵敏度2、灵敏度•报告数据：检测限LOD浓度杂质.A杂质.B杂质.C杂质D杂质.E杂质.F杂质.G主成分定量限LOQ浓度杂质.A杂质.B杂质.C杂质D杂质.E杂质.F杂质.G主成分平均值RSD(1)线性:在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。线形通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率来表示。数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系数、y截距（是检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参数，应列出回归方程数和线性图。(2)范围：指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。有关杂质测定应为被测杂质最低定量限至限度的150%。3、线性与范围3、线性与范围线性与范围试验方法（包括主成分和杂质）•空白溶剂•系统适用性溶液5针•配制从定量限到杂质控制限度的150%的不同浓度样品不少于6个（一般包括定量限、控制限度约50%、100%、150%等浓度）。•从低浓度依次到高浓度依次进样。•系统适用性溶液1针•图谱打印：•系统适用必至少有一针用extendperformance格式打印•其他图谱可用short格式打印。•最后经calibration打出线性图谱及线性方程参数。3、线性与范围•报告数据：提供标准曲线图斜率相关系数Y-截距•评价：相关系数不得小于0.9904、准确度准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。测定回收率的具体方法可采用“加样回收试验法”。加样回收试验：已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M4、准确度•空白溶剂•系统适用性溶液5针•正常样品检测三份•50%加杂样品检测三份•100%加杂样品检测三份•150%加杂样品检测三份•系统适用性溶液1针•图谱打印：•系统适用必至少有一针用extendperformance格式打印，其他图谱可用short格式打印。4、准确度数据报告：规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次。计算9次测定结果的平均值及RSD。平均值应为90%～110%及RSD小于10%。4、准确度2．杂质定量测定的准确度杂质的定量试验可向原料药中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如药典方法或经过验证的方法。如不能测得杂质的相对响应因子，可在线测定杂质的相关数据，如采用二极管阵列检测器测定紫外光谱，当杂质的光谱与主成分的光谱相似，则可采用原料药的响应因子近似计算杂质含量（自身对照法）。已知杂质相对与主成分在HPLC上的响应比值计算方法：(1)可直接用主成分对照品及杂质对照品进行测定。(2)也可由主成分及杂质线性方程中的斜率比求得。5、响应因子精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。6、精密性标准（偏）差（SD）6、精密性相对标准（偏）差（RSD）6、精密性1.重复性:A、在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或（回收率法）B、把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。（样品测定法）6、精密性2.中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。3.重现性不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。一般申报注册不要求数据要求：需报告平均值，RSD。6、精密性•报告数据：•1、回收率、•2、平均回收率、•3、RSD•评价：•1、回收率应为90%~110%•2、RSD不得大于10%6、精密性•供试溶液与对照溶液分别放在室温和冷藏下保存，分别在不同时间测定HPLC•对照溶液峰面积下降值不得过10%•供试品溶液中杂质，峰面积相对偏差不得过10%。7、溶液稳定性•报告数据：•1、样品与对照品的总杂质峰面积及变化率。•2、样品与对照品的已知杂质峰面积及变化率。•3、样品与对照品的最大未知杂质峰面积及变化率。•评价：•1、对照品主峰的下降不得过10%•2、样品与初始值比较，杂质变化不得过10%7、溶液稳定性耐用性指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。它是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。通过在不同的条件下对同一样品的分别测试而获得的。（获得的数据与正常检测下的精密度进行比较，从而确定该法的耐用性，或称粗放度）8、耐用性典型的变动因素包括：流动相的组成流动相的pH值流动相的流速不同厂牌的同类型色谱柱不同批号的同类型色谱柱柱温波长样品溶剂的组成及pH等，其它操作条件同常规检验8、耐用性耐用性试验方法1•空白溶剂•系统适用性溶液5针•正常样品检测三份•50%加杂样品检测三份•100%加杂样品检测三份•150%加杂样品检测三份•系统适用性溶液1针•图谱打印：•系统适用必至少有一针用extendperformance格式打印，其他图谱可用short格式打印。8、耐用性耐用性试验方法2（被测物质有较高的含量）•空白溶剂•系统适用性溶液5针•正常样品检测六份•系统适用性溶液1针•图谱打印：•系统适用必至少有一针用extendperformance格式打印，其他图谱可用short格式打印。8、耐用性数据报告：•求平均值与RSD，RSD小于10%。•与重复性一起共计12个数据，计算平均值与RSD，RSD小于10%8、耐用性序号系统适用性参数测得值限度1分离度3.32NLT2.02标准品图中的理论板数23324NLT50003标准品图中的拖尾因子0.95NMT2.04三针标准液的RSD值.0.03NMT15.0汇总一下系统适用性要求要说明各峰的色谱参数，以extendperformance打印专属性试验说明各已知物质的分离度与峰纯度最低检测限要说明信噪比参数，以performance+noise打印强力试验以DAD检测器试验，要说明分离度、理论板数等要符合全要求，要有主峰和各已知杂峰的峰纯度数据定量限要说明信噪比参数，以performance+noise打印线性与范围要说明线性方程的斜率、截距及相关系数，用Calibration处理后打印出线性图重复性试验要说明各试验数据的平均值与RSD中间精密性试验要说明各试验数据的平均值与RSD准确性试验要说明各试验数据的回收率与RSD耐用性试验要说明分离度、理论板数等要符合全要求，说明各次数据与正常测定数据的RSD，或要说明各试验数据的回收率与RSD。溶液稳定性试验说明供试溶液与对照溶液在常温与冷藏下不同时间的主峰的峰面积与0时时的相对偏差。（常温与冷藏），计算与0小时的峰面积或含量的相对偏差。图谱的要求。每次试验：空白溶剂一至三针系统适用性6针，RSD≤2%后注：•每次分析方法验证试验系统适用性必须符合要求。必须在系统稳定的状态下进行（要有数据表明系统是稳定的）。•验证的图谱要按要求打印。•有些验证需要具体情况具体分析。