荧光定量PCR实验及数据分析

SangonBiotech(Shanghai)Co.,Ltd.荧光定量PCR实验原理及数据分析内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程及注意事项生工荧光定量产品选择指南2原理－－定义实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测原理－－常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值原理－－扩增曲线（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量PCR原理－－荧光阈值（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光定量PCR原理－－Ct值（循环数）Rn（荧光强度）Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：•相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；•Ct值极具重现性荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理＝X0*（1＋En）Ct＝M（1）整理方程式（2）：方程式（1）两边同取对数得：XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为MLog2M＝Log2X0*（1＋En）Ct（2）Log2X0=Log2M-CtLog2（1＋En）荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认•线性关系、扩增效率确认–相关系数（R2）：大于0.98–标准曲线斜率：-3－-3.5–PCR扩增效率（E）：0.9-1.2•检测灵敏度确认–35Cycles内可得到好的定量结果–如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增•Notemplatecontrol确认–35Cycles内无引物二聚体产生内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程及注意事项生工荧光定量产品选择指南14•非特异性荧光标记•SYBRGreenI•特异性荧光标记•TaqManProbeSYBRGreenI染料法－－原理•SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenI染料法－－作用机理染料法－－问题点与关键点•问题点：–SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。•关键点：–设计合适引物，防止非特异性扩增！SYBRGreenI染料法－－融解曲线将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱SYBRGreenI染料法－－融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光：定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光：定量不准确SYBRGreenI染料法－－优缺点使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势优点无模板特异性对引物特异性要求较高不能进行多重定量灵敏度相对较低缺点Taqman探针法－－原理•5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等•3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)•探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光•Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法－－工作机理探针法－－PCR体系的建立1.引物、探针的设计：–探针Tm为68-70℃,30bp,5’不能有G,G可能会淬灭荧光素–引物尽量靠近探针,扩增片段400bp,引物Tm为59-60℃2.反应参数的确定：–一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度3.优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值–引物浓度：100-900nM–探针浓度：50-300nM4.其他与常规PCR相同探针法－－优缺点高度特异性重复性好灵敏度高可进行多重定量优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点实时荧光定量PCR分类－－分子信标标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂实时荧光定量PCR分类－－分子信标分类－－分子信标高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优点只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺点几种荧光定量PCR方法的应用比较适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断分子信标高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析荧光定量PCR技术的主要应用•定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等•绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等•相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程及注意事项生工荧光定量产品选择指南31的解析方法绝对定量解析方法相对定量解析方法32Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量绝对定量分析几要素•一个目的基因——即需要确定其量值的核酸序列。•一组标准样本——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。•重复反应孔–——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。•标记方法的选择——SYBRGreenI法或Taqman探针法均可。•实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。绝对定量质粒标准品的制备质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用质粒标准品稀释方法与拷贝数计算•倍比梯度稀释方法：–1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii–1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii–1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv–1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v•拷贝数的计算：–待测样本浓度（ng/ul）=OD260×40×稀释倍数–样本分子量=碱基数×324–待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量•方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测•标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照•实验步骤：提取HBVDNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数。绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量标准品5×10328.1828.6428.410.16标准品5×10425.2525.1425.190.04标准品5×10522.1122.4622.280.12标准品5×10618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量扩增效率（E）计算E=10-1/斜率-1=10-1/-3.29-1=2.01-1=1.01标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.29x+40.33R2=0.9978152025305×1035×1045×1055×106CopiesCt相关系数（相关系数（RR22）：大于）：大于0.980.98，越接近，越接近11，结果可信度越高。，结果可信度越高。扩增效率（扩增效率（EE）：）：0.80.8--1.2,1.2,越接近越接近11，越理想。，越理想。绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量值带入线性方程：20.5=-3.29X+40.33QuantityUnknown=106.03=1,071,519copiesX=20.5-40.33-3.29=6.03荧光定量PCR的解析方法绝对定量解析方法相对定量解析方法41提取效率相同细胞起始数相同