搜索
微生物次生代谢产物的下游研究方法张翼基本流程菌种发酵培养菌体发酵液前处理、富集提取粗提物分离纯化传统方法色谱方法单体化合物结构鉴定波谱学手段单晶衍射化学反应活性评价、构效关系活性引导分离或系统分离课程安排第一讲：发酵、前处理与传统分离方法第二讲：色谱学原理与实际应用（1）第三讲：色谱学原理与实际应用（2）第四讲：波谱分析概论及紫外、红外、质谱第五讲：一维与二维核磁共振谱第六讲：核磁共振谱解析实例第七讲：其他结构鉴定常用（波谱）方法第八讲：化合物波谱综合解析实例一、发酵培养与提取1.1微生物大规模发酵培养的方式(1)液体静置培养（实验室规模）适用：丝状真菌（三角烧瓶，好氧）厌氧细菌（密封瓶）优点：经济，无需专门设备缺点：生长相对缓慢第一讲发酵、前处理与传统分离方法培养基：碳源/能源、氮源、生长因子、无机盐、水生长曲线及其与次生代谢关系迟滞期、指数期、稳定期、衰亡期种子对发酵的影响(2)摇瓶培养（实验室规模）适用：细菌、放线菌、真菌（厌氧菌不太适宜摇瓶培养，密封瓶一般体积、重量过大）优点：传质好、溶氧充分，从而生长迅速、周期短缺点：要进行大规模发酵需要大量摇床，占用空间大。(3)发酵罐培养通气发酵罐（好氧细菌、放线菌、真菌）厌氧发酵罐（如啤酒、有机酸、酒精的发酵生产，次生代谢研究？）光生物反应器（光合细菌、微藻）优点：传质效率高、溶氧充分（好氧菌）、温度、pH等参数可控，生长迅速，培养量大缺点：昂贵(4)固态发酵适用：丝状真菌与酵母（如醋、酒酿造，豆豉生产等，酶制剂、维生素、生物毒素、抗生素），现在细菌上也有应用优点：供氧充分，散热及时，条件粗放、成本低，下游处理方便缺点：过程控制、大型化等方面有待改进1.2发酵液的前处理含水多，产物含量低；含菌体及水溶性蛋白；溶有原来培养基成分；相当多的副产物和色素；易被杂菌污染或产物可能会分解；易起泡，悬浊物及粘性物质（多糖）多。目标产物胞内产物（菌体）胞外产物（发酵液/水相）1.2.1发酵液的复杂组成/特点1.2.2前处理目的、原则与流程1)时间短；2)温度低；3)pH适中（比较稳妥）；4)生物安全（不可忽视）固液分离浓缩富集目的原则固相（滤渣）：菌体及悬浊物等水相：胞外次生代谢产物（与部分水溶性大分子）发酵液预处理加热（使蛋白质等大分子变性沉淀，慎用/预试验）调pH（同上，慎用/预试验）絮凝（使菌体、悬浮物、大分子、粘稠物等沉淀或吸附聚集，有助滤作用，对于细菌、放线菌、微藻很适用，明矾、硅藻土、纤维素等）固液分离抽滤，过滤，板框式压滤机滤渣（菌体及杂物）水相有机溶剂萃取（按极性递增的顺序）经减压浓缩或不浓缩吸附富集/固相萃取用水、醇的水溶液、丙酮等梯度洗脱大孔吸附树脂、活性炭、亲和柱等通用性好，可按极性实现初步分段，条件简易；但费时、易喷溅、有机溶剂用量大、乳化现象严重大大减少工作量，且可按分子量、极性等实现较好的初步分离，但通用性不及溶剂萃取法溶剂萃取胞内产物甲醇、丙酮、氯仿－甲醇等比较/合并？胞外产物微滤截菌及悬浮杂物超滤除蛋白、多糖等大分子反渗透除盐、单糖、氨基酸等过小分子并除水浓缩效率很高的新思路前处理的一般流程也可索氏提取二、分离与纯化活性引导的分离对于显示有特定生物活性的粗提物，在分离纯化过程中每一步都用该筛选模型跟踪分离有活性的组分，直至分离得到具有活性的纯化合物。特别适用于主要对活性成分感兴趣的研究。优点：是天然产物化学研究的一个重要的新趋势；能集中精力，有目的性的分离想要得到的活性物质；分离和结构解析的工作量相对都较小；有清晰的研究思路，对于文章写作有一定好处。弊端：不能保证有活性的化合物一定为新化合物，有一定风险；有可能会漏掉在该筛选模型中无活性，但有可能具有其他潜在生物活性的新化合物；活性跟踪有时受限于“协同效应”；不方便同时跟踪多种活性两种分离纯化策略活性引导的分离系统分离系统分离对于经过或未经过生物活性筛选的提取物，在分离纯化过程中不经筛选模型的跟踪指导，分离纯化所有能够得到的纯化合物，并解析结构。最后再根据是否为新化合物及化合物的结构特点，参考相关文献报道或活性预测软件等来进行广泛的生物活性筛选。偏重于传统的天然产物化学研究方法，比较适合冷僻的生物材料和不注重生物活性的研究。优点：不容易漏掉提取物中含有的、能分离到的新化合物，有利于专利申请、文章撰写，也能兼顾各种生物活性。弊端：目的性不明确/有一定盲目性；分离纯化与结构解析的工作量巨大；波谱测试费用比较大两种方法相结合，以活性引导为主线，兼顾系统分离基本原则尽量快速低温旋转蒸发（一般低于50摄氏度）；冷冻干燥；样品低温保存避光防氧化旋转蒸发；有些样品需氮气保护溶剂尽量不破坏天然成分丙酮（与二醇反应成缩酮）；乙酸乙酯（成酯）；氯仿（酸性）2.1传统的分离方法(1)萃取/溶剂分配法相似相溶原理极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶。（一条基本原则）如单糖、寡糖、糖苷易溶于水或醇，酚类化合物易溶于甲醇，长链脂类化合物易溶于石油醚、氯仿常用溶剂极性(介电常数)甲酰胺(109)＞水(80)＞甲酸(58)＞乙腈(36.3)＞甲醇(33)＞乙醇(24.3)＞丙酮(20.7)＞正丁醇(17.8)＞乙酸乙酯(6.02)＞乙醚()＞氯仿(5.2)＞二氯甲烷()＞甲苯＞苯(2.3)＞二氯乙烷()＞四氯化碳(2.24)＞二硫化碳()＞环己烷()＞正己烷(2.0)≈石油醚()。影响化合物极性的因素：(1)化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。(2)取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。常见基团极性大小顺序如下；酸＞酚＞醇＞胺＞醛＞酮＞酯＞醚＞烯＞烷。举例：判断下列各组化合物极性大小。OHOCOCH3O实例皂甙类：植物粉碎，乙醇提取，分散于水中，依次用低极性的（石油醚、）氯仿、乙酸乙酯萃取除去亲脂性成分（色素、类脂等），以正丁醇萃取富集皂甙类成分生物碱类：水相调pH碱化,使天然存在的生物碱的有机酸盐转化为游离生物碱，有机溶剂萃取；有机相再用酸水萃取使再转化为盐溶于酸水，色素等杂质残留在有机相中；酸水相再不同程度的碱化，以有机溶剂萃取得到碱性强弱不同的总碱组分。成分类型水醇类亲脂性有机溶剂•游离生物碱－++•生物碱盐++－•苷类++－•苷元－++•挥发油－++•糖类（单糖低聚糖）+±－•（多糖）＋±－•有机酸（大分子）－++•（小分子）++－•树脂－++•氨基酸++－•蛋白质、酶±±－•鞣质++－•色素（亲水性）++－•（亲脂性）－++•油脂、蜡－++小结各种天然生物成分溶解性±：单糖：无水醇难溶；多糖：对醇60%以上难溶。蛋白质、酶：对水热水沉淀；对醇60%以上沉淀。特点：通过合适的萃取方法，能有效地富集目标成分；但一般只是粗分(2)沉淀法利用有机物的溶解性或与某些试剂产生沉淀的性质，沉淀反应可逆。常用：铅盐法（(碱式)乙酸铅使沉淀，通硫化氢脱铅解离。如蒽醌苷、黄酮）；胆固醇可沉淀皂甙；苦味酸可沉淀生物碱。沉淀除杂：用丙酮、乙醇、乙醚等可除去多糖、蛋白质类杂质。特点：有一定特异性，可选择性富集某一类目标组分(3)重结晶法原理利用目标化合物与杂质在溶剂系统中溶解性的差异来纯化。目标产物过饱和析出，杂质全部或大部分留在母液中。1.直接从粗提物或粗组分中重结晶对于微生物来说较少见，植物化学成份研究中常用于高含量组分的初步纯化2.分离纯化过程中（难分离）精细组分的重结晶或制备X-ray衍射所需单晶（常用手段）重结晶方法（达到过饱和方法）1）加热－冷却法（单一溶剂或混合溶剂，对于天然产物不宜过热）选溶剂：取少量产物放人一支试管中，滴人约10倍体积/质量比的溶剂，震荡下观察产物是否溶解，若不加热很快溶解，说明产物在此溶剂中溶解度太大，不适合作此产物重结晶的溶剂;若加热还不溶解，可补加溶剂，当溶剂量大于40倍一产物仍不溶解，则说明此溶剂也不适宜。如所选择的溶剂能在10~40倍体积加热的情况下使产物全部溶解，并在冷却后能析出较多晶体，说明此溶剂适合作为此产物重结晶的溶剂。方法：热溶饱和再加20％溶剂，(预热漏斗抽滤除杂)，冷却结晶，抽滤，尽量少量溶剂洗涤2）溶剂蒸发法（更常用，单一溶剂或混合溶剂）良溶剂：溶解较好，挥发快不良溶剂：溶解较差，挥发慢良溶剂与不良溶剂应互溶比如一化合物在氯仿中溶解度较高，而在甲醇中溶解较低，则少量氯仿配以大量甲醇可能适宜重结晶方法：良溶剂溶解，小心加入不良溶剂至出现混浊刚好不消失，再加入少量良溶剂至刚好溶解，滤纸封口，扎小孔，室温或冰箱放置。或直接以混合溶剂操作。或柱层析试管直接放置。规律：静大动小，浓快稀慢，快小慢大，快杂慢纯常用的重结晶混合溶剂系统：水一乙醇甲醇一水石油醚一苯氯仿一醇苯一无水乙醇水一丙醇甲醇一乙醚石油醚一丙酮乙醇乙醚一乙酸乙醋苯一环己烷水-乙酸甲醇一二氯乙烷氯仿一醚乙醚一丙酮促结晶方法：晶种（不太适用微量天然产物分离）玻棒擦壁(4)色素脱除植物提取物、光合细菌或微藻发酵产物含较多色素，一般价值不高且影响分离，可先除去。方法：1)叶绿素易溶于氯仿、乙醚、石油醚等低极性溶剂,可从水相中萃取除去2）色素一般分子量较大，可用大孔吸附树脂或凝胶柱除去3）色素一般极性也较小，用短C18柱可除去(5)膜分离法适合分开生物大分子与小分子化合物传统方法主要用于粗分，可对目标组分进行一定程度的富集；溶剂分配、沉淀、重结晶等方法的合适运用可以大大减少工作中的干扰，降低分离难度、减少工作量；重结晶方法对于单晶制备非常重要，可用于极复杂化合物的结构鉴定。在小试、中试试验中相对更为重要小结：